HIV感染症の幅広い発展のための構造的基盤

Nature Communications volume 14、記事番号: 2782 (2023) この記事を引用

917 アクセス

9 オルトメトリック

メトリクスの詳細

抗体の親和性の成熟により、さまざまな病原体に対する適応免疫応答が可能になります。 一部の個人では、広範な中和抗体が発達し、広範な配列多様性を持つ急速に変異する病原体を認識します。 したがって、HIV-1 やインフルエンザなどの病原体に対するワクチンの設計は、自然な親和性成熟プロセスを再現することに重点を置いています。 今回、我々は、DH270抗体クローンB細胞系統を標的とする広範囲に中和するHIV-1 V3-グリカンの観察されたすべてのメンバーおよび祖先状態について、HIV-1エンベロープと複合した抗体の構造を決定した。 これらの構造は、変異していない共通祖先からの中和幅の発達を追跡し、高い空間分解能で親和性の成熟を定義します。 抗体開発のさまざまな段階で重要な変異によって媒介される接触を解明することにより、親和性最適化の焦点となるエピトープ-パラトープ界面上の部位を特定しました。 したがって、我々の結果は、自然な親和性成熟への道におけるボトルネックを特定し、ワクチン接種による広範な中和免疫応答の誘発を目的とした免疫原設計に情報を提供するこれらに対する解決策を明らかにする。

生殖細胞系列にコードされた重鎖および軽鎖の免疫グロブリン (Ig) 遺伝子からの抗体の親和性成熟には、体細胞超突然変異と選択、その後の B 細胞の増殖と分化の繰り返しが含まれ、最終的には病原体の中和につながります 1。 ハイスループットの次世代シークエンシングと抗体開発を追跡する方法の出現により、親和性成熟プロセスを綿密にモニタリングできるようになりました 2,3。 抗体単独、または同族抗原と接触した抗体に関する広範な構造ベースの研究により、親和性の獲得には、抗体と抗原の接触、形状の相補性、パラトープの剛性、および抗体の立体構造を改善する変異の獲得が関与していることが明らかになりました 2,4,5,6,7。 8. 成熟には、親和性に依存しない多様化も含まれており、これらが連携して、親和性の最適化問題に対する幅広い潜在的な解決策につながります 4,9。 中和幅を持つ抗体は、配列の多様性にもかかわらず標的抗原に効果的に結合することができ、HIV-1、インフルエンザ、SARS-CoV-2、その他のヒトコロナウイルスなどの病原体に対する主要なワクチン設計の標的となっています10、11、12。

インフルエンザや SARS 感染症は通常、感染後比較的短期間で治癒しますが、HIV-1 はゲノムに組み込まれた慢性感染症であり、広範な中和抗体 (bnAbs) をもたらす抗体の成熟は複数年にわたってのみ発生します。 免疫原設計に戦略的に情報を提供し、ワクチン接種によるこのプロセスの加速を可能にする抗体成熟経路を定義することが、現在の HIV-1 ワクチンへの取り組みの主な目標です 13。 HIV 感染者 (PLWH) から広範な中和抗体が単離されており、bnAbs の誘導を目的とした多くのワクチン戦略の基礎となります 14。 HIV-1 指向性 bnAb の開発では、通常、抗体クローン内で重鎖 Ig/軽鎖 Ig ペアの特異的に位置する一連の変異を定義する必要があり、bnAb 開発の再現を目的とした免疫原設計においては、大きな課題となります。 これは、広範な体細胞変異、長い重鎖の第 3 相補性決定領域 (HCDR3)、Ig の挿入と欠失、生殖系列遺伝子の使用の制限、および確率の低い変異の濃縮などの一般的ではない HIV-1 bnAb の特徴によって悪化します 15、16、17。 したがって、親和性成熟した bnAb B 細胞の決定要因を同定するには、望ましい bnAb 応答をもたらす後天的変異と生産性の低いオフターゲット応答に至る後天的変異の区別を含む、bnAb 開発につながる親和性成熟段階の詳細な理解が不可欠です。受容体（BCR）の選択。

HIV 感染時のウイルスと抗体クローンの共進化を研究することは、bnAb 開発中に進化する HIV-1 エンベロープ (Env) バリアントを定義することによってワクチン設計に情報を提供し、反復免疫原設計の青写真を提供します 7、18、19、20。 HIV-1 bnAb の標的は、Env タンパク質上の保存されたエピトープです21、22、23、24。 HIV-1 Env は gp120-gp41 ヘテロ二量体の三量体であり、N 結合型グリコシル化によって宿主免疫系から厳重に保護されており、立体構造マスキングとかなりの配列変動によって中和からさらに保護されています。

HIV-1 Env の 3 番目の可変ループ (V3) の基部近くのグリコシル化領域は、複数の HIV-1 感染者の多様な生殖系列遺伝子に由来する抗体の標的となる脆弱性のスーパーサイトを形成します 25。 広範に中和する V3 グリカン抗体の開発は、マラウイ出身のエイズを患うアフリカ人男性 (CH848、クレード C) を対象に研究され、感染時から伝播後 5 年間追跡調査されました 20。 CH848 個体では、2 つの自己の「協力する」中和 B 細胞クローン (DH272 および DH475) の初期の出現によりウイルス エスケープ バリアントの選択がもたらされ、次にそれが DH270 クローンを刺激し、DH270 クローンがさらに発達して強力な中和幅を獲得しました 20。 DH270 系統は、それぞれ VH1-2*02 および Vλ2-23 重鎖および軽鎖遺伝子に由来し、重鎖相補決定領域の長さは 20 アミノ酸残基 20 であり、DH270.6 は最も幅が広く、系統のメンバーです。効力は、幾何平均効力約 0.21 μg/ml で多分岐シュードウイルス パネルの 51 パーセントを中和します 26。 重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子の体細胞変異レベルがそれぞれ 12.8 パーセントと 6.7 パーセントである DH270.6 は、変異が最も少ない V3 グリカン bnAbs26 の 1 つです。 DH270 抗体は 186 週目に CH848 個体で検出され、可変ループ 1 (V1)20 が短縮された Env 変異体の出現と一致しました。 DH270 クローンのナイーブ B 細胞前駆体を表す、推定される DH270 の変異していない共通祖先抗体 (DH270.UCA) は、重鎖の 57 位の単一アミノ酸がグリシンに置換されているにもかかわらず、異種 HIV-1 を中和しません。アルギニン (G57R) は、範囲は限られていますが、異種 HIV-1 中和をもたらしました。 DH270 クローンの親和性が成熟し、抗体の重鎖および軽鎖可変領域 (VH および VL) に変異が蓄積するにつれて、異種中和の幅と効力が向上しました。 初期の DH270 祖先中間抗体は、短い V1 ループを持つ異種ウイルスを中和することができました。 DH270 B 細胞クローン系統は、効力は低下しますが、より長い V1 ループを持つウイルスを中和する能力を獲得するように進化しました 20。 効力と V1 長との間の同様の逆相関が、他の V3 グリカン bnAb 10-1074、PGT121、および PGT12827,28 についても観察されました。 DH270 クローン 20 で利用可能な共進化抗体と Env の豊富なデータセットは、親和性成熟とウイルス共進化の構造的側面を前例のない詳細レベルで研究し、この情報がどのようにワクチン設計に影響を与えるかを定義する機会を提供しました。 V3-グリカンスーパーサイト。

3 つの重要な発見により、DH270 クローンに関する現在の理解が深まりました。 まず、体細胞超突然変異は確率論的過程ですが、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ (AID) 媒介の体細胞突然変異の抗体配列にはホット スポットとコールド スポットが存在し、抗体残基が突然変異する確率に違いが生じます。 これに、複数の塩基の変更が必要になる可能性があることと組み合わせると、特定の突然変異が低確率で発生する可能性があります (ここでは 2% 未満と定義されます)。 DH270 クローンを含む HIV-1 bnAb には、重要な低確率変異が豊富に含まれています 17。 第二に、このクローンの最も広範囲で強力なメンバーにある 42 個の変異のうち、その幅の 90% に達するのに必要な変異は 12 個だけであり、これにより最適化が必要な抗体の最も重要な領域を正確に特定できるようになります 29。 最後に、ワクチン開発の文脈で親和性成熟を考慮するための鍵となる、合理的に設計された免疫原が DH270 bnAb V3 グリカン前駆体を拡張できることを示しました 21。

ここでは、cryo-EM を使用して、完全に推定された DH270 クローン ツリーと共進化するウイルス Env との相互作用を視覚化しました。 我々は、感染中にウイルスのV3-グリカンエピトープを保護するためにウイルスによって取り付けられた防御機能を定義し、DH270クローンがどのようにして最初にEnvに関与するように発達し、その後成熟してこれらの障壁を効果的に回避して中和幅を達成したかを実証します。 我々の結果は、クローン開発には、特定の抗体-抗原接触部位での親和性を高めるための逐次的な解決策が含まれていることを示しています。 開発の各段階で、溶液の取得に続いてクローンを個別のサブクローンに分割し、親和性と中和幅の差異をもたらしました。 これらの結果は、クローンの初期に獲得された突然変異が下流の DH270 クローン親和性成熟の運命を決定することを示しました。 抗体の成熟には、抗原表面に蓄積する回避的変異として焦点が移動する部位とのエピトープ-パラトープ接触の段階的な部位特異的最適化が含まれていました。

推定される DH270 UCA、および CH848 個体から単離された成熟 DH270.3、DH270.5、および DH270.6 抗体を含む、いくつかの DH270 抗原結合フラグメント (Fab) の構造が以前に決定されています。 さらに、DH270.1 一本鎖可変フラグメント (scFv)、マンノース関連 DH270.3、V3 グリカンペプチド関連 DH270.6 scFv、および可溶性 Env 外部ドメイン結合 DH270 UCA および DH270.6 Fabs20 の構造が決定されています。 、21、30。 V3 グリカンに関連する DH270.6 の構造は、中和の幅に重要な個々の残基の役割を明らかにしましたが、この幅の進化の根底にある構造経路は明らかにしておらず、幅と効力がさまざまな DH270 クレードおよびサブクレード。 したがって、我々は、各抗体祖先中間体およびすべての成熟抗体形態からのHIV-1 Env関連DH270クローンメンバーFabの低温EM構造を決定することにより、成熟の各段階での突然変異の影響を決定しようとしました（図1および補足図1）。および2）。 感染後949日目にCH848個体から単離されたウイルスに由来する可溶性SOSIP三量体（ここではd949 Envと呼ぶ）を、構造研究用のDH270クローンFabとの複合体の調製に使用した。 このエンベロープは、感染患者における DH270 系統の出現に時間的に近いこと、およびすべての DH270 系統メンバーと相互作用するため、選択されました。 Env 定数を使用すると、観察されたすべての構造の違いは抗体のアミノ酸の違いに起因すると考えられます。 マップ解像度は 5.3 ～ 3.3 Å の範囲で、Fab-Env インターフェイスでのローカル解像度は 5 ～ 3 Å の範囲でした（補足図 2 ～ 4、表 1 および 2）。

A (左上) gp120 (青) および gp41 (オレンジ) サブユニットを強調表示する DH270 抗体 Fab 結合 HIV-1 エンベロープ (Env) 細胞外ドメイン。 抗体 Fab の重鎖と軽鎖はそれぞれ赤と灰色に色付けされており、エピトープグリカンはスティックで示されています。 (右) パラトープ-エピトープ接触部の拡大した上面図と側面図。 破線の円は、個別の接触領域を示します。 (左下) 番号インジケーターは、右側のパネルの破線の円で強調表示されている接触部位を識別します。 B CH848 d949 三量体に結合した各クローン メンバー Fab について決定されたクライオ EM マップを示す推定 DH270 クローン系統樹 (白)。 クローン メンバー名は、各マップの Fab カラーに従って色付けされます。 黒の番号は、A に列挙した部位に応じた各抗体の結果的な変異の位置を示します。最も広範で強力な成熟型である M6 に至る経路上の抗体の親和性はピンク色で示されています。 中間クローンメンバーは I で示され、成熟抗体は M で示されます。

DH270 クローンの変異をクライオ EM 構造上にマッピングすると、B 細胞クローン ツリーに沿って連続的に変異しているクラスター化された部位が明らかになりました (図 1A)。 これらのクラスターは、抗体/Env 接触の 7 つの異なる部位にマッピングされました: (1) Env N332 グリカンの遠位 D1 アームと、軽鎖が関与する Fab 可変重鎖セグメントと軽鎖セグメント (VH/VL) の間に形成された裂け目との相互作用。鎖相補性決定領域 2 (LCDR2) および重鎖相補性決定領域 3 (HCDR3)、(2) N332 グリカン GlcNac 塩基と抗体 HCDR3 領域の相互作用、(3) Env V1 ループとFab HCDR3およびHCDR2領域を含むV3ループ内の保存されたGDIR/Kモチーフ、(4) Env N156-グリカンのDアームと抗体フレームワーク領域との相互作用、(5) Env N301-グリカン塩基GlcNac-の相互作用1およびV3 GDIR/Kモチーフ周囲の残基とFab LCDR3領域、(6) Env N301-グリカン分岐点およびDアームとFab LCDR1/VL N末端部位との接触、および(7) Env N301-グリカン分岐点およびDアームのFab LCDR1/VL N末端部位との接触。 Fab LCDR1 領域を持つ N442 グリカン (図 1A)。 これらは共に、DH270 クローン抗体が利用できる相互作用表面全体を構成します。

クライオ EM 再構成は、Ab/Env インターフェイスで解析され、原子モデルの構築が可能になりました。 相互作用強度の強化による界面解像度の改善の明確なパターンは観察されませんでした。 これは、クライオ EM データセットの変動と、親和性成熟中の DH270 系統の熱安定性の低下による可能性があります 6。

DH270 クローンツリーに沿って、上記の Env 相互作用部位で明らかな変異パターンが出現しました。これは、DH270 クローンが親和性成熟経路上の特定の連続的な構造ボトルネックを解決するために進化していることを示唆しています (図 1B)。 最初の中間体である I5 は、タンパク質間接触および抗体と N301 グリカンの相互作用を改善することにより、クラスター 3 および 6 での相互作用を強化する変異を獲得しました。その結果、d949 Env に対する結合親和性が、従来の中間体と比べて約 8 倍向上しました。 UCA。 中間体 I5 の後、クローンは、I3 中間体によって定義されるクレードと I4 中間体によって定義されるクレードに沿って 2 つの異なる経路に分岐します。 この結果的な分割により、I3 クレードにおけるより広い中和幅と効力の獲得がもたらされ、DH270.6 bnAb が生成されます (図 1B)20。 両方のクレードは、N332-グリカン相互作用部位の周囲で、ただし異なる位置で変異を獲得しました。 I3 中間体は遠位 N332 グリカン D1 アーム (クラスター 1) との相互作用を改善し、I4 中間体は N332 グリカン GlcNac 塩基 (クラスター 2) との相互作用を改善します。 次に、各中間体が 2 つのサブクレードに分割され、4 つの成熟/中間抗体のうち 3 つによる接触最適化のための保存された Env ターゲットが明らかになります。 これらには、I4 クレード成熟抗体 DH270.3、I3 クレード成熟抗体 DH270.1、および中間抗体 I2 が含まれます。これらはすべて、抗体 LCDR3 領域内またはその近傍にクラスター化されたいくつかの変異を示し、おそらく Env N301 グリカン塩基との相互作用を改善します (クラスター5)。 I4 クレード成熟抗体 DH270.2 はクラスター 1 に焦点を当てた変異を獲得し、I3 中間体と同様の方法で N332 グリカン D1 アームでの相互作用を改善しました。 I2 中間体は、クローンの最も広範で強力な抗体である成熟 DH270.6 とクラスター 3、4、および 7 で追加の変異を獲得し、クラスター 7 での相互作用をさらに変更しました。最小変異 DH270 抗体 (minDH270) が設計されました 29。 DH270.6 の幅と効力の約 90% に達するには、DH270.6 の 42 個の変異のうち 12 個が必要でした。 重要なのは、変異には I5、I3、および I2 に出現した変異のみが含まれていることです。 この観察と一致して、以下に説明するように、I2 後の変異はより遠位の部位で発生し、その影響は DH270 クローンの以前のメンバーに現れた変異に比べて明らかではありませんでした。 DH270.5 および DH270.6 抗体は、N301 グリカン D アームとの相互作用が発生する可能性がある LCDR1/VL N 末端付近でいくつかの変異を獲得しました。 この領域のクライオ EM 再構成は解像度が低く、これらの相互作用を正確に定義することができませんでした。 まとめると、これらの結果は、DH270 クローンの成熟には異なる部位での連続的な親和性の増加が関与し、親和性の増加と中和幅の発達には特定の構造的解決策が必要であることを示しています。 これは、抗体 LCDR3 領域における変異の獲得により、DH270.1 および I2 中間体では中和幅が増加しましたが、DH270.3 では中和幅が減少したという二分法で例示されています。

次に、各段階での成熟の基礎となる特定の構造配置を研究し、最初に I5 中間体の変異を調べました (図 2A、B)。 我々は以前に、位置 133 および 138 の V1 ループグリカンが除去された CH848 d949 Env 三量体に結合した DH270 UCA および成熟 DH270.6 Fab の構造を決定しました 21。 UCA結合構造では、V1ループは抗体、V3 GDIKモチーフおよび隣接するV3残基と相互作用しますが、DH270.6結合Envでは、V1ループはこの位置から移動され、V3 GDIKと相互作用しなくなります。モチーフ。 この置換は、最初の中間体で発生する VH G57R 変異に起因すると考えられました21。 V3 グリカン bNAb エピトープで抗体に結合していない場合の V1 ループの立体構造を視覚化するために、CD4 結合部位抗体 VRC01 と複合体を形成した d949 SOSIP Env の構造を決定しました。 我々は、非結合V1ループの立体構造がUCA結合V1ループの立体構造に似ていることを発見した（補足図6A）。 我々はさらに、CH848 d949 SOSIP Envと複合体を形成するVH G57R変異を組み込んだDH270.UCAの構造を決定した（図2Cおよび補足図6B）。 UCA + G57R構造のV1ループは、V3 GDIKモチーフと相互作用してそれを遮蔽する、遊離型およびUCA結合型で観察される位置から移動しました（補足図6C）。 UCA + G57R 構造における V1 ループの変位は、抗体の配向の顕著な変化を伴い、Fab VH/VL を V1 ループが以前に占めていた空間に向かって回転させ、抗体を Env に近づけます (図 2C)および補足図6D）。 UCA+G57R結合複合体の構造をI5結合複合体と比較すると、I5中間体における他の後天的変異によって調整された抗体の配向のさらなる変化が明らかになった。 N301 グリカンの β-マンノース分岐点付近の VL S27Y 置換がおそらく原因であり、UCA+G57R 結合複合体と比較して I5 結合複合体における N301 グリカンの配向を変化させます (図 2D)。

UCA および I5 中間抗体を強調表示する DH270 クローン ツリー。 B I5 コンタクトサイトの上面図と側面図。 重鎖および軽鎖の変異のアルファ炭素 (Cα) は球として表示されます。 C 抗体の位置とEnv gp120 V1 ループのシフトを強調する gp120 と接触する UCA および UCA+G57R 重鎖の上面図。 UCA-G57R結合Env V1の破線の漫画表現は、V1のマップ密度が弱い残基133と153を接続しています。 D UCA + G57R Fab 結合三量体複合体のガウス フィルター マップ (灰色) と I5 Fab 結合三量体複合体のフィルターおよびサブトラクション マップ (緑色) が重ねられています。 地図上の S27Y 変異の位置はオレンジ色で示されています。 E (左上) 接触角θと二面角ファイ。計算に使用した重心の位置を球で示します。 (左中)UCAおよびUCA+G57R結合状態構造のアライメント(gp120のみ)。シータ角に関する抗体の性質の変化を強調している。 (左下)UCA+G57RおよびI5結合状態構造のアライメント(gp120のみ)。ファイ二面体周りの抗体の性質の変化を強調している。 (右上) gp120 エピトープ重心からの抗体 Fab VH/VL 重心距離。 (右下) UCA、UCA+G57R、および I5 構造のシータ対ファイのプロット。 データポイントの色は、構造内のそれぞれの重鎖の色と一致します。

次に、抗体 Fv とその gp120 エピトープの間のベクターベースの角度を使用して、抗体配向のこれらのシフトを定量化しました。 エピトープ、Fv、および VH のアンカー ポイントの重心を使用して、Fv とそのエピトープの間の距離および角度 (シータ) を決定し、エピトープの追加のアンカー ポイントを追加して、エピトープの回転 (ファイ) を調べました。エピトープに対する抗体 (図 2E)。 シータとファイは、エピトープを基準とした抗体の接近角度を表し、クローンに変異が蓄積するときの抗体の性質の違いを詳しく検査することができます。 抗体とエピトープ間の距離は、UCA結合構造と比較してUCA+G57R結合構造において約0.5Å減少し、追加のI5変異に関連してI5ではさらに小さな減少が観察された（図2E）。 UCA 構造と UCA+G57R 構造の角度と二面体配置を比較すると、それぞれ約 2°の回転が見られました。 I5 中間体は、シータ回転角の追加の変化なしに、S27Y 変異の方向にファイ二面体の周りでさらなる回転を示しました。 まとめると、これらの結果は、DH270 クローンの初期変異が接触の改善を促進し、結合した Env に対して抗体の位置を移動させ、特に V1 ループと N301 グリカンの Env 立体構造を変化させ、角度および立体構造の変化をさらに強化することを示しています。抗体と環境の相互作用。

次に、I5 中間体からの DH270 クローンにおける 2 つの異なるクレードの初期発生を調べました (図 3A、B)。 DH270.6 クローンの I5 の後に発生する I3 中間体には、重鎖変異 V11M、R87T、およびありそうもない R98T 変異、および軽鎖変異 L48Y および S54N が組み込まれています。 I3 Fab 結合 Env のクライオ EM 再構築は、4.5 Å の分解能で決定されました。 VH 残基 R57 によって誘導された V1 ループの立体構造変化は、VL 残基 Y27 と N301 グリカンの相互作用と同様に保持されました (図 3B および補足図 7A、B)。 I5およびI3 Fab結合Env構造gp120およびgp41サブユニットには大きな違いは観察されませんでした（RMSD〜0.9Å;補足図7C）。 前述したように 30、VL L48Y および VH R98T 変異は、Y48 ヒドロキシルが N332 グリカンと相互作用する新しい水素結合接触を導入し、R98T 変異による D115 の放出により、N332 グリカンとの D115 水素結合相互作用の数が増加します。 (図3Cおよび補足図7D)。 さらに、I3 VH R98T 置換により、残基 T98 の側鎖と VH Y27 の間に水素結合が導入され（補足図 7E）、R98 のカチオン - π 相互作用の損失を補うことによって抗体構造の内部安定性が強化されました。 Y27と。 VH R87T および VL S54N 変異は、抗体の gp120 相互作用領域から離れています。 これらの変異の局所領域を詳しく調べると、抗体の内部安定性の増強におけるこれらの置換の潜在的な役割が示唆されました。 VH R87T 置換は、空間的にクラスター化された 3 つのアルギニン、R67、R85、および R87 によって寄与される静電歪みを軽減します (図 3D および補足図 7F)。 注目すべきことに、このクラスターの 2 番目のアルギニンである R85 は、I3 が I2 に移行する次のステップでセリンに変異します。 さらに、T87 側鎖は残基 VH D89 の主鎖窒素と水素結合を形成し、局所構造の安定性を高めます。 VL S54Nの効果はより微妙であり、N54は側鎖と軽鎖残基66の主鎖との水素結合を介して隣接するβ鎖との相互作用を安定化させるようである（補足図7G）。

I5、I3、および I4 中間抗体を強調表示する DH270 クローン ツリー。 B I3 および I4 コンタクト サイトの上面図。 重鎖および軽鎖の変異のアルファ炭素 (Cα) は球として表示されます。 C (左) N332 グリカン D1 アームが I5 VH/VL クレフトと接触しています。 (右) N332 グリカン D1 アームが I3 VH/VL 裂け目に接触します。 D 潜在的な N156 グリカン接触付近の R87T 部位における I3 中間体の構造。 E 肘角度の変化を強調する整列した I5 および I3 VH ドメイン (マゼンタ)。 F (左) I4 HCDR3 S108Y 変異部位で形成された新しい N332 グリカン接触の座標をマップしてフィットさせます。 (右) HCDR3 ループ配置を示す、整列した I5 および I4 VH ドメイン。

I5 と I4 抗体の構造は類似しており、以前の分子動力学シミュレーション 6 で予測されたように、I3 の V11M 変異は抗体 Fab エルボ ヒンジの顕著な変化を誘導しました (図 3E)。 I3とは異なり、I4中間体は肘の突然変異を獲得せず、その結果、肘領域に明確な変化を示さなかった（補足図7H）。 I3 と同様に、I4 の R57 残基は V1 ループの位置をシフトしている証拠を示しました (補足図 7I)。 ただし、この領域では、GDIK 結合 V1 ループと一致する追加の密度が観察され、マルチステート動作を示唆しています。 I4 中間体は、HCDR3、Y106V、および S108Y の 2 つを含む多数の VH 変異を獲得しており、これらは本質的にチロシンの位置を残基 106 から 108 に移動させます。I4 Y108 のヒドロキシル基は、N332 GlcNac-2 と水素結合を形成しました。 (図3F左)。 HCDR3 バックボーンの立体構造は、これらの変異によって変化しませんでした (図 3F 右)。 I4 S84R 変異は、N156 グリカンの遠位糖ユニットの近くにあります。 ただし、N156 グリカンの側鎖とこの部分の密度は、クライオ EM 再構成では見ることができませんでした (補足図 7J、K)。 I4 重鎖の G49A、N54T、Q62R、および Y116S の位置にある残りの変異は、Env との相互作用または抗体構造の修飾において明確に解読できる役割を果たしていません。 軽鎖には、2 つの非パラトープ変異、R56W および V100I が含まれています。 I5 または I3 と比較して、V100I 位置の周囲には変化は観察されませんでした。 LCDR2領域に隣接するI4軽鎖の残基R59Wは、遠位のN332-グリカン相互作用残基の位置をシフトする適度な再配列を示した（補足図7L）。 これは、抗体とグリカンの相互作用における明らかな変化とは関連していませんでしたが、LCDR2 ループ、ひいてはグリカン相互作用の安定化をもたらす可能性があります。 これらの観察は、開発のこの段階では、N332 グリカンとの相互作用が DH270 クローン ツリーの両方のクレードで最適化の焦点であったことを示しています。

I4クレードは、成熟抗体DH270.2およびDH270.3につながります(図4A、B)。 DH270.2 は、24 ウイルス異種パネルからそれぞれ 10 名と 15 名のメンバーを中和することにより、DH270.3 よりも広い範囲と効力を示しましたが、どちらも 16 ～ 17 名のメンバーを中和する I3 クレード成熟抗体と比較して弱い中和範囲と効力を示しました。異種パネルの２１． Env結合構造のアライメントにより、I4中間体と比較して各抗体の配向に明確な変化が明らかになった(図4Cおよび補足図8A)。 シータ角とファイ角を検査すると、DH270.3 が主にエピトープ周りの回転をシフトしていることが示されました (図 4D)。 DH270.3 における最も注目すべき変異は、軽鎖 Y27S 復帰でした。 I4 中間体と比較して、N301 グリカンの位置の明らかなシフトが観察されました (図 4E および補足図 8B)。 UCA+G57R/Env複合体に対するI5/Env複合体における結合抗体の観察された回転と一致して、Y27S復帰によりDH270.3はUCA+G57Rと一致する配向を占めた(図4F)。 この抗体の配向の逆転は、I5 で最初に獲得された S27Y 置換が、UCA から I5 に移行する際に観察された抗体の回転と N301 グリカンの再配向の原動力であることを示唆しています。

I3 および I2 中間抗体と成熟 DH270.1 (M1) 抗体を強調した DH270 クローン ツリー。 B I2 および DH270.1 コンタクト サイトの上面図。 重鎖および軽鎖の変異のアルファ炭素 (Cα) は球として表示されます。 C I3 および I2 結合状態構造のアラインメント (gp120 のみ)。gp120 V1 ループ配置のシフトと、I2 R84 側鎖と N137 グリカン間の接触を強調しています。 D gp120 V1 ループ間の立体構造の類似性を強調する UCA と I2 結合構造のアライメント (gp120 のみ)。 E (右) gp120 エピトープ重心からの抗体 Fab VH/VL 重心距離。 (左) I3、I2、および DH270.1 構造のシータ対ファイのプロット。 データポイントの色は、構造内のそれぞれの重鎖の色と一致します。 F I3 と I2 の間の LCDR3 領域エピトープ接触の側面図の比較。LCDR3 立体構造の変化 (マゼンタの矢印) が強調表示されます。 G I3 と I2 の間の LCDR3 領域エピトープ接触の上面図の比較。芳香族残基 93 回転異性体のシフトを強調しています (マゼンタの矢印)。 H Y106S 変異を強調する DH270.1 マップを使用した I3 と DH270.1 の結合状態構造のアライメント (gp120 のみ)。

ありそうもない VH G110Y 変異を含む変異のクラスターが、V3 GDIK モチーフに隣接するループと N301 グリカン GlcNac 塩基の間の接触付近の DH270.3 LCDR3 内およびその周囲で発生します。 追加の変異、F93S、A94T、G95N、および S97A は、N301-グリカン相互作用のリモデリングをもたらし、最初の N301-GlcNac との相互作用および 2 番目の N301-GlcNac との N95 の相互作用のために LCDR1 Y32 側鎖の位置をシフトします (図４Ｇ）。 角度シフトおよび LCDR3 関連変異に加えて、HCDR3 の G103S 変異により、N332 グリカン GlcNac-2 N-アセチル部分との水素結合が追加されます (補足図 8C)。 DH270.3 変異は N301 グリカンとの相互作用を最適化しましたが、DH270.2 変異は代わりに D1 アーム N332 グリカン相互作用に焦点を当てました。 3 つの重鎖変異 R98K、W101Y、および D115N のうち、D115N 変異は相互作用に最も明らかな変化を示しました。 D115N で負電荷が失われると、アスパラギン側鎖が正電荷 K98 から約 1.6 Å (D および N Cγ から R Nε または K Cε) 離れて移動し、N332 グリカン D1 アームとの広範な水素結合ネットワークを形成することができました。 (図4H)。 これは、I3 の R98T 変異を反映しており、D115 は正に荷電した VH 残基 R98 との相互作用から解放され、N332 グリカンと結合します。 まとめると、Env に結合した DH270.2 および DH270.3 構造の分析は、それぞれが異なる部位を標的として異なる発生経路をたどったことを示唆しています。 DH270.3 と比較して DH270.2 抗体の幅が広いのは、DH270.2 における N332 グリカン相互作用の改善と DH270.3 における Y27S 復帰の複合効果である可能性があります。

DH270 クローンの I3 クレードにおける開発の次の段階では、Env 結合親和性 (図 1B) と HIV-1 中和幅が最も大幅に向上しました 20。 I3中間体はI2中間体と成熟DH270.1抗体に分割され、どちらも主にLCDR3領域に焦点を当てた変異を獲得します（図5A、B）。 I2-Env 複合体のクライオ EM 再構成における注目すべき特徴は、構成が変更された、よく分解された V1 ループです。 I2 重鎖 S84R 変異部位と接触した V1 ループ N137 グリカンについても、十分に分解された密度が観察されました (図 5C および補足図 9A)。 この変異は I4 中間体でも発生し、V3 GDIK モチーフと結合した V1 ループについて、明確ではないものの同様の密度を示しました。 V1 ループの再配向により R57 が V3 GDIK モチーフの方向に移動し、D325 との相互作用が生じました (補足図 9B)。 この V1 ループの配向は、R57 を収容するためにループにねじれが導入された UCA 結合三量体構造に似ていました (図 5D)。 抗体の配向を定量化すると、このループの再配置に対応するために、I2 VH/VL が V1 ループから離れる方向に回転することが示されました (図 5E)。

I4 中間抗体、成熟 DH270.2 (M2) および DH270.3 (M3) 抗体を強調した DH270 クローン ツリー。 B DH270.2 および DH270.3 のコンタクト サイトの上面図。 重鎖および軽鎖の変異のアルファ炭素 (Cα) は球として表示されます。 C (左) 抗体の性質の変化を強調する I4 と DH270.2 の結合状態構造のアラインメント (gp120 のみ) (右) 抗体の性質の変化を強調する I4 と DH270.3 の結合状態構造のアラインメント (gp120 のみ)。 D I4、DH270.2、および DH270.3 構造のシータ対ファイのプロット。 データポイントの色は、構造内のそれぞれの重鎖の色と一致します。 E 抗体軽鎖上の S27 または Y27 残基の配置および位置の変化を示す I4 および DH270.3 N301 グリカンの構造オーバーレイ。 F 同様の結合状態配置を示す UCA+G57R および DH270.3 結合状態構造のアライメント (gp120 のみ)。 G I4 (上) 構造と DH270.3 (下) 構造間の LCDR3 と gp120 タンパク質および N301 グリカンとの接触部位の比較。 H I4 (上) 構造と DH270.2 (下) 構造間の N332 グリカン D1 アーム抗体接触の比較。

I2中間体とDH270.1は両方とも、DH270.3で観察されたものと同様のいくつかのLCDR3修飾変異を獲得します（図5F、Gおよび補足図9C、D）。 DH270.1では、エピトープの遠位にあるLCDR3塩基でいくつかの変異が発生し、それらが一緒になってLCDR3領域を安定化した可能性があります（補足図9E、F）。 同様の変異がI2中間体でも発生し、最も顕著なのはLCDR3塩基に空間的に隣接するF101C変異であり、これにより抗体の残基91と101の間で追加のジスルフィド結合が形成されます（補足図9D）。 この変異は、DH270.6 幅の約 90% に達するために必要な、前述の最小限の変異セットの 1 つです 29。 LCDR3 内のかなりの数の変異、および LCDR3 に影響を与える変異も minDH270 構築物の一部であり、I2 中間結合構造におけるエピトープ相互作用に明確な影響を及ぼします。 これらには、VH G110Yと連携してLCDR3領域の再配列を引き起こし、N301 GlcNac-1 N-アセチル部分が存在するポケットを作成するVL Y93F、A94G、およびS97Aが含まれます（図5F）。 このポケットの形成におけるありそうもないHCDR3 G110Y変異の重要な影響は、立体閉塞によるF93回転異性体のシフトである(図5G)。 さらに、DH270.1 では HCDR3 Y106S 変異が発生し、2 つの影響が生じます。 第一に、Y106 の側鎖と W101 の主鎖との間の水素結合が失われ、第二に、Y106 側鎖と N332 グリカンとの相互作用が解放されます。 これらは一緒になって、グリカン N332 が W101 側鎖とより効果的に結合できるようにすることで、グリカン N332 と HCDR3 の相互作用を調節するように作用する可能性があります (図 5H)。 これらの結果は、DH270.3 で観察された LCDR3 変化と併せて、この部位での相互作用の修飾が親和性成熟に不可欠であることを示唆しています。

I2 中間体から、クローンは 2 つの経路に分岐し、DH270.6 が最大の効力を持っていますが、どちらも同様の中和幅に達します (図 6A、B)20。 I2 からの上のパスは I1 中間体につながり、その後成熟 DH270.4 および DH270.5 抗体につながります。 この I1 サブクレードの変異は一般に抗体と抗原の相互作用表面から遠く離れており、構造的影響はあまり明らかではありません。 I1では、LCDR2ループに影響を与える可能性のある2つの変異、N62HおよびR65Wが、N332-グリカンD1アームの相互作用に影響を与える可能性があります（図6Cおよび補足図10A）。 しかし、このループはあまり解決されておらず、これらの変異が影響を及ぼしている場合、それがどのような影響を及ぼしているかを判断する能力が制限されていました。 DH270.4では、VH S85R変異がN156-グリカンと相互作用する位置に配置されている(図6Dおよび補足図10B)。 ただし、I1 中間変異の場合と同様、この領域はあまり分解されていないため、相互作用は確認できません。 N301-グリカン D アームの密度は明確に定義されていませんでしたが、DH270.5 と DH270.6 の両方の VH および VL は、N301-グリカン D アームの近くでいくつかの変異を獲得しました（図 6E、F、および補足図）。 10C、D）。 Ｖ３ ＧＤＩＫ結合および非共役Ｖ１ループ状態の両方と一致する密度は、ＤＨ２７０．６結合三量体において明らかであった（図６Ｈおよび補足図１０Ｅ、Ｆ）。 DH270.6におけるさらなる突然変異は、N442-グリカンおよびV3 GDIKモチーフから置き換えられたV1ループ構成の近くで発生した(図6G、H)。 これらの構造を調べると、I2 後の変異が主にエピトープより遠位の領域で発生したことが示され、DH270.6 によって中和されたウイルスのほとんどを中和する I2 の能力と一致します。

I2 および I1 中間抗体、および成熟 DH270.4 (M4)、DH270.5 (M5)、および DH270.6 (M6) 抗体を強調表示する DH270 クローン ツリー。 B I1、DH270.4、DH270.5、および DH270.6 コンタクト サイトの上面図。 重鎖および軽鎖の変異のアルファ炭素 (Cα) は球として表示されます。 C I1 VH/VL と N332 グリカン D1 アームの構造。VL N62H および R56W 変異の位置を示します。 D S85F 変異と N156 グリカン間の接触の可能性がある位置を示す DH270.4 重鎖の構造。 E N301 グリカンに近位の DH270.5 VH/VL 変異の構造。 F N301 グリカンに近位の DH270.6 VH/VL 変異の構造。 G N442 グリカンに近位の DH270.6 VL 変異の構造。 H DH270.6 VH の構造は、gp120 V1 ループの 2 つの異なる状態を示しています。

まとめると、DH270 クローン全体の構造決定により、HIV-1 中和の幅が V3 グリカン スーパーサイト指向性 DH270 クローンで発達する複雑なプロセスが明らかになりました。これには、初期のありそうもない I5 中間体の G57R および S27Y 変異が抗体の配向を変化させ、異種中和をもたらしています。幅。 I5 から I3 および I4 中間体までの 2 つの異なるクレードの開発により、どちらも N332 グリカン相互作用の改善が得られ、DH270 クローンにおける N332 グリカン結合の重要性がさらに強調されました。 しかし、それぞれはグリカンの異なる部位を標的としており、I3 は遠位 D1 アームを安定化し、I4 は GlcNac 塩基を安定化しました。 I4 から DH270.2 への下流の成熟は、DH270.2 が N332 グリカン D1 アームの I3 と同様の変異を獲得するため、これが N332 グリカン相互作用を獲得するための理想的な解決策ではなかったことを示唆しています。 I3 以降、I2 および DH270.3 に続く DH270.1 はすべて、LDCR3 および隣接する残基にかなりの数の変異を示します。 DH270.3 は G110Y や S94A など、中和に重要ないくつかの変異を獲得していますが、Y27S 復帰の選択によりその幅が制限されている可能性があります。 DH270.1 が安定化する LCDR3 変異を獲得したのに対し、かなりの中和範囲を開発した I2 は LCDR3 の立体構造を改変し、N301 とグリカンの塩基の接触点を安定化しました。 これは少なくとも 5 つの残基によって媒介されており、それぞれ単独では限られた親和性の増加しか得られなかった可能性があります。 DH270.3 の場合、最初に N332 グリカン D1 アームを安定化していれば、LCDR3 部位の最適化に関連する限られた利益は扱いやすかったかもしれません。 I2 中間体の下流のパラトープ修飾は一次エピトープから離れており、親和性、幅、および効力を微調整するように作用すると考えられます。 minDH270 抗体 29 は I5 から I2 への変異のみを必要とし、この観察と一致しています。 これらの結果は、アフィニティー成熟中の選択を一連の構造的ボトルネックに絞り込むことができ、開発中の抗体クローンが個別のパスに分割されるときに最適なソリューションと準最適なソリューションを示していることを示しています。

DH270 クローンにおける HIV-1 中和幅の進化は、抗体の成熟を促進する Env タンパク質の重要な変化を伴う、ウイルスとの共進化を背景に起こり、またその逆も同様です 20。 まず、CH848 HIV-1感染者の感染中にDH270エピトープがどのように進化したかを調べました（補足図11）。 最初の DH270 クローン抗体は感染後 793 日から 1304 日の間に出現し、同時に Env V1 ループ長が 18 ～ 19 アミノ酸減少し、感染後 699 日目に出現した DH270 エピトープに近い位置での Env の G300N 置換が発生しました。 -感染(図7A)。 初期の I5 および I3 中間体は、これらの短い V1 ループと G300N 変異を含む Env のみを認識します。 初期の DH270 クローン抗体 I5 および I3 によって駆動される Env 選択と一致して (補足図 12A)、より長い V1 ループと G300 を持つ自己ウイルスが感染後 1304 ～ 1431 日で再出現します。 より長い V1 ループ長と G300 の両方をもつウイルスを中和する DH270 クローンの能力は、I2 中間体に現れます (図 7A、補足図 12)。 CH848 準種におけるより長い V1 ループと残基 300 の変異の認識は、これらの特徴を持つ異種ウイルスの DH270 抗体認識にも反映されており、I5 および I320 と比較して I2 および DH270.6 の幅の拡大に寄与しています。

抗体と Env の共進化のタイムライン。 上のボックスは、各時点の環境が初期中間体 (上) および後期中間体/成熟 (下) クローン メンバーに対して感受性 (緑色) であるか耐性があるかを示します。 長い V1 ループが優勢である感染期間は灰色で示され、主要な変異時点がタイムライン軸に沿って強調表示されています。 感染後３５８、５２６、８３６、および９４９日目に単離された配列についてＥｎｖ構造を決定し、Ｄ２７０クローンが強調表示された期間を伴うタイムライン軸上で強調表示した。 B (左) V1 および V3 GDIR/K モチーフを強調した単一の gp120/gp41 プロトマーの側面図。 (右) 各 Env 分離株の V1 ループ構造。 C (左) V1 および V3 GDIR/K モチーフを強調した単一の gp120/gp41 プロトマーの上面図。 リガンド非結合 d358 (左中)、リガンド非結合 d949 (右中)、および I3 結合 d949 (右) 構造に適合するマップと構造。 D エピトープ構造の類似性を示す I3 (左) と I2 (右) 結合構造。 E エピトープ構造の類似性を示す DH270.6 結合 d526 構造 (左) および DH270.6 結合 d949 構造 (右)。

これら 2 つの初期の中間耐性の特徴に基づいて、それぞれ G300 と 18 アミノ酸と 28 アミノ酸の長い超可変 V1 ループの両方を持つ 358 日目と 526 日目の Env を選択し、N300 と短い超可変 V1 の両方を持つ 836 日目と 949 日目の Env を選択しました。 11 アミノ酸のループを解析し、DH270 抗体相互作用に対する構造的ハードルを特定します。 まず、ELISAによって各Env SOSIP外部ドメインへのクローン抗体の結合を調べました（補足図13）。 以前の観察と一致して、UCAはd949構築物への結合のみを示し、I5はd949およびd836構築物に結合した。 I3 は d358 構築物への結合を示しましたが、I4 は示さなかった。 これらのクローンの初期成熟の違いと一致して、成熟DH270.2およびDH270.3抗体は、I2、I1、およびDH270.4-6と比較してd358構築物への結合が弱かった。 DH270.2もDH270.3もd526構築物には結合しなかったが、I2、I1およびDH270.4-6への測定可能な結合が観察されたが、相互作用は他の3つの構築物に対するものより弱かった。 配列類似性が低いにもかかわらず、リガンドのない各 Env 構造の V1 ループ領域を調べると、構造的に保存された疎水性コアと、V1 ループと V3 GDIR/K モチーフの結合を確実にする可変の水素結合および/または塩橋形成が実証されました。 ｄ３５８ Ｅｎｖ Ｖ１は、ループの一部にかなりの乱れを示し、隣接する疎水性相互作用と塩橋相互作用により、ループがＶ３ ＧＤＩＲ／Ｋモチーフ上で閉じたままであることが保証された（図７Ｂおよび補足図１４Ａ）。 d526 Env は同様の疎水性コアを含み、より長い長さにも関わらずより秩序を示しました。 これは、Ｖ１ループと近くのＮ３３２グリカンとの直接相互作用によるものであった（図７Ｂおよび補足図１４Ｂ）。 d836およびd949 Env V1は著しく短かったが、以前のウイルスの疎水性コアおよびV3 GDIR/Kモチーフ結合位置を依然として保持している(図7Bおよび補足図15)。 ｄ８３６ループは、Ｖ３ ＧＤＩＲ／Ｋモチーフ付近のループにねじれを示し、モチーフの露出がいくらか大きくなった（図７Ｂおよび補足図１５Ｃ）。 まとめると、これらの結果は、保存された疎水性コアによって媒介される中和感受性V3 GDIR/Kモチーフを保護するというV1の共通の役割を示している。

次に、クローン開始に関連する Env G300N 置換の DH270 エピトープに対する影響を調べました。 V3 GDIR/K モチーフは 300 位の近位にあり、一対の壊れたベータ シート二次構造を形成しています。 G300 を含む d358 および d526 Env マップにおける V3 GDIR/K モチーフの目視検査により、N300 を含む d836 および d949 Env マップと比較して破断シート構造のより大きな無秩序が示唆されました (図 7C)。 N300 は、非結合状態で V3 GDIK モチーフの I326 主鎖と水素結合接触を形成しました。 この相互作用は、V3 GDIK モチーフの立体構造にほとんど変化がなく、初期中間体の結合状態構造に保持されます (図 7C)。 これらの結果は、G300N が DH270 エピトープを安定化し、UCA と初期中間体がウイルスに結合して中和できるようにすることを示唆しています。 残基 N300 での変異は感染後 1431 日目に発生し始めます (補足図 11)。この時点でグリシンおよびチロシン変異体がアスパラギン変異体と共循環します。 これは、Env 残基 300 に近い LCDR3 変異が I2、DH270.1、および DH270.3 で発生する頃に発生しており、クローン内のこれらの変異に対して進化中のウイルスが選択されたことを示唆しています。 Env に結合した I3 構造と I2 構造を比較すると、それらのエピトープ構成に全体的な変化はほとんどないことが示されました (図 7D)。 さらに、G300を含むd526 EnvおよびN300を含むd949 Envに結合したDH270.6の構造は、全体のエピトープ立体構造にほとんど変化を示さない(図7Eおよび補足図14B)。 LCDR3変異の主な効果は、LCDR3の剛体化とN301-グリカン塩基とのより緊密な接触であり、非リガンド状態または結合状態における結合状態の配置にはほとんど変化がなかったので、これらの変異体はエピトープの柔軟性の増加を補うことによって相互作用を強化したと考えられる。 V1ループの外側および位置300の追加の共進化Env部位には、324GDIR/K327モチーフの位置325〜327および位置328が含まれた（補足図11右）。 感染後 1304 日から N301、N332、および N442 グリカン シークオンを除去する変異も発生しました。 成熟 DH270.4 に耐性のある自己ウイルスは、主に D325N 置換が豊富でしたが、301、332、および/または 442 のグリカンも欠失していました。D325N に対する明らかな構造的影響は、すべてのウイルスでの濃厚接触中に観察されませんでした。グリカンを含む構造は、その損失が実際に DH270 抗体結合に大きな影響を与えることを示唆しています。 まとめると、これらの結果は、ウイルス進化がG300Nを介してGDIR/Kエピトープを安定化し、保存されたV3ループV3 GDIR/Kモチーフの長いV1ループ保護を除去することによってDH270クローン進化を開始したことを示す。 これらの保護機能の回復により、柔軟性の向上に対抗するためにパラトープの安定化に向けてクローンの成熟が促進され、その結果中和の範囲が広くなったと考えられます。

今回我々は、一連のクライオEM構造を研究し、それらをプロトタイプV3-グリカンHIV-1広範中和抗体B細胞クローンにおける抗体親和性結果と相関させた。 我々は、I5中間抗体による異種幅の獲得に必要な初期のG57RおよびS27Y変異がEnvに対する抗体の配向を変化させ、この抗体位置の変化が下流の抗体開発に影響を及ぼした可能性があることを実証した。 DH270.6 の親和性成熟の次のステップには、分岐グリカンの異なるアームをターゲットとするにもかかわらず、N332 グリカン相互作用の周囲に変異を獲得する I3 中間体と I4 中間体の両方による N332 グリカンとの相互作用の最適化が含まれます。 I4 から DH270.2 への成熟には、I3 と同様に N332 グリカン D1 アームの近位に変異を獲得することが含まれており、N332 グリカン相互作用を最適化するには、D2/3 アームではなく D1 アームを関与させる方が良い解決策であることが示唆されます。 DH270.2 が I4 の選択が理想的ではなかったことを示している場合、DH270.3 は重要な分岐点からの移行が早すぎることに問題があることを示しています。 I3 後、I2 および DH270.1 および DH270.3 への展開はすべて、LDCR3 および隣接残基にかなりの数の変異を示し、I2 が最大の中和幅と効力を獲得しました。 I2 中間体の下流のパラトープ修飾は一次エピトープからさらに離れているように見え、親和性、幅、および効力を微調整するように作用したと考えられます。 これらの結果は、段階的で部位特異的な発生が下流の DH270 クローン親和性成熟の運命を決定することを示しました。

抗体B細胞クローンを標的とした広範に中和するインフルエンザ血球凝集素に関する最近の研究では、親和性の成熟には、さらなる最適化が広範な応答を誘導できる潜在的なソリューションの多様なプールの開発が含まれることが示唆されています4。 その研究と一致して、今回我々は、異なる突然変異が病原体によって引き起こされる同様の問題を解決することを発見した。 しかし、これらの解決策は必ずしも同等に効果的であるとは限らず、クレード変異の類似性によって証明されるように、開発中のクローンは親和性を獲得するための最適な解決策に向かって進化しているように見えました。 インフルエンザ bnAb4 に基づいて開発されたこの抗体の「多能性」仮説を裏付けるものは、ワクチン設計に厄介な問題を引き起こします。 クローンの特定のエンドポイントは、その幅と効力特性のために望ましいため、これらのエンドポイントに向けて、中和の幅を確保するための生産性の低いソリューションから遠ざける、開発中の反応を慎重に誘導することが必要になる可能性があります。

我々の結果は、エピトープとパラトープのペアリングの問題の解決策が、一緒に発生するのではなく、クレードの多様化をもたらすことを示しました。 DH270 クローン全体の観点から見ると、クローン メンバー DH270.1 および DH270.3 の場合と同様に、最適な解決策の獲得に失敗すると、さらなる親和性の成熟が制限されます。 したがって、bnAb 系統成熟の初期段階で特定の問題部位における抗原認識の最適な解決策を獲得できないと、その後の系統メンバーにおける好ましい開発中和幅が妨げられる可能性があります。 DH270 クローンの場合、I5 G57R および S27Y 変異の選択を誘導できないワクチン接種は、I3 R98T および L48Y 変異の獲得を制限する可能性があります。 さらに、我々の結果は、DH270 クローンが HIV-1 中和幅が大幅に異なる解決策に到達するまでにどのように異なる経路をたどったかを示しました。 どのエピトープ部位がより優れた中和幅を持つ変異の選択に関与しているかを知ることで、目的の変異に有利な正の示差的親和性利得を生み出す免疫原修飾を正確に選択できるようになります。 個別に親和性の増加をもたらす可能性が高い 2 つの重要な変異を含む I3 とは異なり、I2 は複数の LCDR3 変異を獲得し、それらが連携して Env との相互作用を修飾しました。 個別に親和性を改善するのにほとんど効果がない複数の変異を誘発する必要がある場合は、免疫原の特性を超えて、アジュバント、ワクチン接種のタイミング、追加免疫原の数と正体に関連する問題まで考える必要がある可能性があります。

私たちの研究は単一の V3 グリカンを標的とする bnAb クローンの成熟経路に焦点を当てていますが、多様な V3 グリカンを標的とする抗体間にはいくつかの類似点が存在します。 成熟経路の具体的な詳細は異なる可能性がありますが、この部位を標的とする抗体は、異種の中和幅を獲得するための最適な解決策に到達するために、同様の構造的障壁を回避する必要があります。 これらの構造的障壁の鍵となるのは、開発中の抗体が保存された V3 GDIR/K モチーフにアクセスするために回避する必要がある V1 ループと、エピトープグリカン、主に N332 グリカンです。 実際、これら 2 つの構造モチーフを同時に認識する能力により、V3 グリカン bnAb または前駆体が定義されます。 DH270 クローンは、これらのエピトープ部位がクローン開発の初期に関与しており、DH270 UCA がすでに N332 グリカンを包含する方向にあることを示しています。開発の次のステップは、V3 GDIK に関与するための VH G57R 変異の獲得です。モチーフ。 したがって、中和幅がまったくまたはほとんど観察されないクローン開発の初期段階であっても、V3 GDIR/K モチーフおよび N332 グリカン内に収まる抗体の配向は、中和幅がまったくまたはほとんど観察されない V3 グリカン抗体の重要な構造サインです。異種中和の幅を獲得します。 これは、V3 GDIR/K モチーフには関与するが、N332 グリカンには関与しない他の空間的に近位の HIV-1 Env 頂点を標的とする自己抗体とは対照的です 31、32、33。

新たな証拠は、効果的な HIV-1 ワクチンには、複数の Env 脆弱性部位を標的とするポリクローナル bnAb 応答の誘導が必要であることを示唆しています 26。 この困難な課題を実現するための 1 つの方法は、生殖系列前駆体 B 細胞の既知の bnAb 変異を選択できる免疫原を設計することです。 この研究におけるマッピング抗体 bnAb 開発は、このような正確なクローンベースの免疫原開発へのロードマップを提供します。 抗体と抗原の界面で異なる構造要素を単離することで、獲得部位を確立でき、各部位に関連する構造的問題を個別に解決するための免疫原を開発できます。 特定の管理可能なステップに焦点を移すことにより、合理的なアフィニティー設計は、明確なデータを欠いた推測的な最終免疫原設計のセットを実装しようとするのではなく、明確に定義された一連のターゲットを介して進めることができます。

統計的推論は、DH270 系統抗体と CH848 HIV-1 Env の共進化の調査において重要な役割を果たします。 抗体クローンツリー再構築では、最尤法に基づく統計的推論を使用して、B 細胞クローンの祖先状態を表す内部ノードの抗体配列を推定します。この方法の精度は、クローンに対してサンプリングされた利用可能な配列データと使用される進化モデルによって制限されます。 したがって、ここおよび他の研究 8,34 で使用された DH270 クローンのクローン ツリーは、Cloanalyst プログラム 35 のデフォルト パラメーターと、抗原によって回収された DH270 クローンの 6 対の重鎖および軽鎖からの配列データを考慮した最良の推定値を表しています。特定の単一 B 細胞のソーティング。 私たちの長期的な Env 配列分析も、統計的推論と、クローン系統メンバーのウイルスの中和と呼気を増強する抗体変化に対して特定の Env 特徴が選択される可能性との関係に依存しています。 したがって、DH270 系統の抗体変異の構造的影響と共進化の状況における特定の Env 変異の影響に関する我々の報告は、これらの推論の真実性に依存しています。 さらに、系統を開始した正確な Env 配列、および DH270 クローン系統の発達を駆動したさまざまな配列の数は不明です。

ウイルスと抗体クローンの変化は自然な共進化中に同時に発生しましたが、私たちの構造観察のほとんどは単一の Env の使用に依存しています。これは、949 日目に CH848 個体から分離されたウイルスに由来する可溶性 SOSIP 三量体です。伝染 ; 感染。 これにより、共進化プロセスの忠実な構造レプリカを作成することはできなくなりましたが、耐性の出現と駆動の決定要因となった特定の環境残基の変化に焦点を当てることで、共進化に関する有意義な洞察を収集しながら、データセットを管理しやすく保つことができました。抗体の進化。 私たちの戦略により、環境の同時変化に混乱することなく、抗体残基の変化の影響を研究することができました。 最後に、異なる時点で生じた、異なる中和特性と抗体結合に対する構造的障壁を持つ選択された環境を研究することで、共進化へのさらなる洞察を加えました。

Expi293 細胞 (ThermoFisher カタログ番号 A14527) を、Expi293 培地で 2.5 × 106 細胞 mL-1 の濃度で最終容量 0.5 L まで希釈しました。 400 マイクログラムの重鎖および軽鎖プラスミドを Expifectamine (ThermoFisher カタログ番号 A14526) と複合体化し、Expi293 細胞に添加しました。 5日目に、遠心分離および0.8μM濾過によってトランスフェクション細胞培養培地から細胞を除去した。 組換え抗体を含む上清をプロテイン A 樹脂 (ThermoFisher) とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 プロテインA樹脂を遠心分離により回収し、培養上清を除去した。 樹脂を、合計３４０ｍＭのＮａＣｌを含有する２５ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。 合計 30 mL の 10 mM グリシン pH 2.4、150 mM NaCl を使用して、プロテイン A 樹脂から抗体を溶離しました。 溶出された抗体溶液のpHは、1M Tris pH 8.0の添加により約7に上昇した。 抗体溶液を遠心分離を繰り返して PBS に緩衝液交換し、濾過し、-80 °C で保存しました。

CH848 SOSIP gp140 エンベロープの産生は、Freestyle293 細胞 (ThermoFisher カタログ番号 R79007) を使用して実行されました。 トランスフェクション当日、Freestyle293 を新鮮な Freestyle293 培地で 1.25 × 106 細胞/mL に希釈し、合計容量を 1 L にしました。 細胞を、650μgのSOSIP発現プラスミドDNAおよび293Fectin（ThermoFisherカタログ番号12347019）と複合体化した150μgのフリン発現プラスミドDNAで同時トランスフェクトした。 6日目に、細胞培養物を3500rpmで30分間遠心分離することによって細胞培養上清を回収した。 細胞を含まない上清を０．８μｍのフィルターで濾過し、使い捨てタンジェンシャルフロー濾過カセットを用いて１００ｍＬ未満に濃縮し、再度０．８μｍで濾過した。 三量体 Env タンパク質をモノクローナル抗体 PGT145 アフィニティークロマトグラフィーで精製しました。 PGT145結合樹脂をTricornカラム(GE Healthcare)に充填し、0.05%アジ化ナトリウムを添加したPBS中で保存した。 AKTA Pure (GE Healthcare) を使用して、無細胞上清を 2 mL/min でカラムに適用し、洗浄し、タンパク質を 3M MgCl2 でカラムから溶離しました。 溶出液を直ちに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８で希釈し、０．２μｍで濾過し、サイズ排除クロマトグラフィーのために２ｍＬまで濃縮した。 サイズ排除クロマトグラフィーは、10mM Tris pH 8、500mM NaCl中でSuperose 6 16/600カラム(GE Healthcare)を用いて実施した。 三量体 HIV-1 Env タンパク質を含む画分を一緒にプールし、滅菌濾過し、瞬間冷凍し、-80 °C で保存しました。

CH848 DS SOSIPトリマーに対するDH270系統FabのSPR結合曲線は、HBS-N 1×ランニングバッファー中のBiacore S200装置(Cytiva)またはPBS 1×pH7.4中のBiacore 3000装置(Cytiva)のいずれかを使用して得た。 DH270 Fab I5.6、I3.6、I2.6、および DH270.6 の親和性測定では、ビオチン化 CH848 DS SOSIP トリマーをストレプトアビジンを介して CM3 センサー チップ上に 280 ～ 290RU のレベルで固定化しました。 シングルサイクル注入タイプを使用して、50 ～ 1500 nM に希釈した Fab を 6 回連続注入し、固定化 SOSIP トリマー上に 50 μL/min で濃度ごとに 120 秒間注入し、その後 600 秒の解離期間を設けました。 Fab は、50 μL/min の 25 mM NaOH の 20 秒パルスで再生されました。 結果は、Biacore S200 評価ソフトウェア (Cytiva) を使用して分析されました。 ブランクのストレプトアビジン表面およびバッファー結合を二重参照サブトラクションに使用して、非特異的抗体結合およびシグナルドリフトを考慮しました。 カーブ フィッティング分析は、局所 Rmax を備えた 1:1 Langmuir モデルを使用して実行されました。 DH270UCA3 Fab の場合、ビオチン化 CH848 DS SOSIP トリマーは、ストレプトアビジンを介して 290 ～ 300RU のレベルで CM5 センサーに固定化されました。 DH270UCA3 Fab を 500 ～ 3000 nM に希釈し、K-inject 注入タイプを 50 μL/min で使用して、各濃度を SOSIP Trimer 表面上に 300 秒間注入しました。 600 秒の解離期間の後に、50 mM NaOH の 20 秒パルスによる表面再生が続きました。 結果は、BIA評価ソフトウェア（Cytiva）を使用して分析されました。 ブランクのストレプトアビジン表面と結合バッファーを二重参照サブトラクションに使用しました。 DH270UCA3 Fab のカーブ フィッティング分析は、局所 Rmax を備えた 1:1 Langmuir モデルを使用して実行されました。 すべての Fab について報告された結合曲線は、1 つのデータセットを表しています。

CH848 SOSIP 三量体複合体は、6 倍モル過剰の Fab とインキュベートした 2 mg/ml 三量体のストック溶液を使用して調製しました。 ガラス化中の三量体複合体の空気-水界面との相互作用を防ぐために、サンプルを 0.085 mM n-ドデシル β-D-マルトシド (DDM) 中でインキュベートしました。 サンプルをプラズマ洗浄した QUANTIFOIL ホーリーカーボングリッド (EMS、R1.2/1.3 Cu 300 メッシュ) に適用し、その後 30 秒間吸着させ、濾紙でブロッティングしました。 次いで、ＥＭ ＧＰ２プランジフリーザー（Ｌｅｉｃａ、相対湿度９０〜９５％）を使用して、グリッドを液体エタン中でプランジ冷凍した。

クライオ EM イメージングは​​、300 kV で動作する FEI Titan Krios 顕微鏡 (Thermo Fisher Scientific) で実行されました。 データ収集画像は、EPU ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) を使用して、-1.0 ～ -3.5 μm のデフォーカス範囲で 1.08 Å の校正済み物理ピクセル サイズで計数モードで動作する Falcon 3EC または K3 直接電子検出器で取得しました。 顕微鏡にはエネルギーフィルターや Cs コレクターは取り付けられていませんでした。 検出器の線形範囲での動作を保証するために、使用した線量率は約 0.8 e-/Å2 s でした。 総露光時間は 60 秒で、中間フレームは 2 秒ごとに記録され、累積線量は約 42 e-/Å2 となり、画像あたり合計 30 フレームとなりました。

Cryo-EM の画質は、自動処理ルーチンを使用してデータ収集中にオンザフライで監視されました。 データセット DH270.I3、DH270.I2、DH270.6、DH270.I4、および DH270.2 については、粒子ピッキング、複数回の 2D 分類、ab initio 再構成、均質マップ改良、および非均一なマップの改良。 残りのデータセットは、次に説明するようにマップの品質を向上させるために、cryoSPARC の外部でさらに処理されました。 動画のフレームアライメントは UNBLUR37 を使用して実行され、CTF の決定は CTFFIND438 を使用して実行されました。 粒子は、検索テンプレートとして半径 80 Å のガウス ディスクを使用して自動的に選択されました。 選択されたすべての粒子は、384 ピクセルのボックス サイズで抽出され、192 ピクセル (ビニング 2) にスケールダウンされ、cryoSPARC36 で生成された ab-initio モデルを使用して、cisTEM39 で 8 ラウンドの精製が行われました。 cisTEM によって各粒子に割り当てられたスコアの分布は、明確な二峰性分布を示し、より高いスコアを含むグループ内の粒子のみがさらなる処理のために選択されました。 粒子のきれいなサブセットがビニングなしで再抽出され、ローカル リファインメントが 10 回反復され、続いて EMAN240 で生成された形状マスクを使用してさらに 5 回反復されました。 次に、FSC 曲線のさらなる改善が観察されなくなるまで、粒子ごとの CTF 改良を実施しました。 この時点で、粒子フレームが生データから再抽出され、すべてのムービー フレームを使用して粒子ごとの動き補正が行われ、データ駆動型の線量重み付けスキームが適用されました 41。 新しい局所的に整列した粒子は、cryoSPARC にエクスポートされ、均一なリファインメントと不均一なリファインメントの追加ラウンドが実行されました。

DH270.I3、I4、および DH270.5 を使用したエルボ角度解析では、対称拡張後のクリーンな粒子を使用した局所焦点リファインメントが crioSPARC で行われました。 次に、対応する精製パラメータとともに粒子を RELION 3.142 にエクスポートし、T=25 を使用して位置合わせなしで 3D 分類を実行しました。

各抗体の構造は、Modeller43 および利用可能な Fab 結晶構造 20、30 を使用して調製されました。 SOSIP Env 構造は、モデラーと DH270.6 結合 CH848 949 日目三量体 (PDB ID 6UM6 鎖 A および B) を使用して調製されました 21。 PDB ID 3NGB44 の VRC01 の座標 (チェーン H および L)。 クライオ EM マップの構造フィッティングは、Isolde アプリケーション 46 を使用して ChimeraX45 で実行されました。 構造適合およびマップ品質統計は、それぞれ MolProbity47 および EMRinger48 を使用して決定されました。 糖鎖は、シャープ化されたマップとガウス フィルター処理されたマップの組み合わせを使用してフィッティングされました (標準偏差 1.0 ～ 1.5)。 構造およびマップ分析は、PyMol49 と ChimeraX の組み合わせを使用し、VMD50 を使用して計算されたシータ角度とファイ角度を使用して実行されました。 静電ポテンシャル マップは PyMol で生成されました。

SOSIP タンパク質への抗体の結合は、384 ウェル ELISA プレートを使用してテストし、0.1 M 重炭酸ナトリウム中の 2 mcg/ml の抗体で 4 °C で一晩コーティングしました。 プレートをＰＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で洗浄し、アッセイ希釈剤（４％（ｗ／ｖ）乳清タンパク質／１５％正常ヤギ血清／０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０／０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で室温で１時間ブロックした。 1時間。 精製したSOSIPタンパク質を、10mcg/mlで開始して1時間、2倍段階希釈で添加し、続いて洗浄した。 コーティングされた抗体へのSOSIPの結合は、ビオチン化ヒト抗体PGT151を0.125 mcg/mlで1時間使用して検出した。 PGT151を洗浄し、続いてストレプトアビジン-HRP(Thermo Scientific #21130) 1:30,000で1時間洗浄した。 プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ基質（ＳｕｒｅＢｌｕｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ－＃５１２０－００８３）で発色させ、続いて１Ｍ ＨＣｌで反応を停止させた。 最後に、450 nm での吸光度 (OD450) を 384 ウェル プレート リーダー (Molecular Devices、Spectramax 384 plus) で測定しました。

シグネチャ分析に使用される Env シーケンスは、Bonsignori et al.20 からのものです。 シーケンス ロゴの生成には、ロス アラモス HIV データベースの Web ツール AnalyzeAlign が使用されました。 自己中和データは Bonsignori et al.20 からのものです。 感染後 78 日から 1720 日の間にサンプリングされた TF および代表的な長期的 Env を含む 90 個の自家 Env 偽ウイルスで測定されました。 以前の研究の中間体は、今回の研究のように 6 つではなく 5 つのクローン メンバーで推定されましたが、中間体 I5、I3、および I2 はそれぞれ、Bonsignori et al.20 の IA4、IA2、および IA1 に非常に密接に対応します。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究中に生成された Cryo-EM 再構成および原子モデルは、wwPDB および EMBD (www.rcsb.org; http://emsearch.rutgers.edu) で次のアクセッション コードで入手できます: Cryo-EM 再構成およびこの研究中に生成された原子モデルこの研究は、wwPDB および EMBD (www.rcsb.org; http://emsearch.rutgers.edu) で次のアクセッション コードで入手できます: EMD ID: EMD-40282、EMD-40283、EMD-40285、EMD-40286、EMD -40287、EMD-40288、EMD-40291、EMD-40290、EMD-40289、EMD-40284、EMD-40280、EMD-40280、EMD-40278、EMD-40277、EMD-40275、EMD-40281、EMD-40279 、EMD-40274、EMD-40273、および PDB ID: 8SAW、8SAX、8SAZ、8SB0、8SB1、8SB2、8SB5、8SB4、8SB3、8SAY、8SAU、8SAU、8SAS、8SAR、8SAQ、8SAV、8SAT、8SAN、8SAL。

Vajda, S.、Porter, KA & Kozakov, D. 抗体成熟の理解の向上に向けた進歩。 カー。 意見。 構造体。 バイオル。 67、226–231 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mishra, AK & Mariuzza, RA 次世代シークエンシングから抗体の親和性成熟の構造基盤を洞察します。 フロントイミュノール。 9、117 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wardemann、H. & Busse、CE 免疫グロブリン レパトアを分析するための新しいアプローチ。 トレンド免疫。 38、471–482 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

McCarthy Kevin, R.、Raymond Donald, D.、Do Khoi, T.、Schmidt Aaron, G. & Harrison Stephen, C. インフルエンザ血球凝集素に対するヒトの体液性反応における親和性の成熟。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 116、26745–26751 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シュミット、AG et al. 広範に中和するインフルエンザウイルス抗体の親和性成熟中の抗原結合部位の事前構成。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 110、264 (2013)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

ヘンダーソン、R.ら。 免疫グロブリン肘領域変異の選択は、HIV-1 広範中和抗体のドメイン間の立体構造の柔軟性に影響を与えます。 ナット。 共通。 10、654 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ボンシニョーリ、M. 他生殖細胞系列から CD4 模倣抗体の広範な HIV-1 中和剤までの成熟経路。 セル 165、449–463 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, JO、Zaidi, HA、Ton, T. & Fera, D. HIV-1 広範中和抗体系統における抗体親和性成熟に対する可変ドメイン界面でのフレームワーク変異の影響。 フロントイミュノール。 1529 年 11 月 (2020 年)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アイゼン、HN 抗体の親和性強化: 免疫応答の初期に生成された低親和性抗体に、その後のメモリー B 細胞応答で高親和性抗体がどのように続くか。 がん免疫。 解像度 2、381–392 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Stephenson, KE、Wagh, K.、Korber, B. & Barouch, DH HIV-1 予防のためのワクチンと広範な中和抗体。 アンヌ。 イミュノール牧師。 38、673–703 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ニューサウスウェールズ州ローセンおよびアイオワ州ウィルソン インフルエンザウイルスに対する広範な中和抗体。 アンチビル。 解像度 98、476–483 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

サンダース、KO et al. パンデミックおよび出現前のコロナウイルスに対する中和抗体ワクチン。 ネイチャー 594、553–559 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mu、Z.、Haynes、BF & Cain、DW ワクチン接種によって HIV に対する広範な中和抗体の複数の系統を誘発するための戦略。 カー。 意見。 ヴィロル。 51、172–178 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haynes, BF、Kelsoe, G.、Harrison, SC、および Kepler, TB は、ケーススタディとして HIV-1 を用いたワクチン開発における B 細胞系譜免疫原の設計を行っています。 ナット。 バイオテクノロジー。 30、423–433 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヘインズ、バートンF. 他。 HIV と宿主の相互作用: ワクチン設計への影響。 細胞宿主微生物 19、292–303 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

クライン、F.ら。 免疫グロブリンフレームワークの体細胞変異は、一般に広範囲かつ強力な HIV-1 中和に必要です。 セル 153、126–138 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiehe、K.ら。 HIV 広範な中和抗体の開発に対するありそうもない抗体変異の機能的関連性。 Cell Host Microbe 23、759–765.e756 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haynes, BF、Kelsoe, G.、Harrison, SC & Kepler, TB ケーススタディとして HIV-1 を用いたワクチン開発における B 細胞系譜免疫原設計。 ナット。 バイオテクノロジー。 30、423–433 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Liao、HX et al. 広範囲に中和する HIV-1 抗体と創始者ウイルスの共進化。 ネイチャー 496、469–476 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ボンシニョーリ、M. 他 HIV-1 グリカン依存性の広範な中和抗体の段階的誘導。 科学。 翻訳。 医学。 9、eaai7514 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

サンダース、KO et al. B細胞成熟を操作することによるHIV特異的抗体変異の標的選択。 サイエンス 366、eaay7199 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ward, AB & Wilson, IA 三量体 HIV-1 エンベロープ糖タンパク質構造に関する洞察。 トレンド生化学。 科学。 40、101–107 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Steichen、JM et al. 広範な中和抗体反応をプライミングするための一般化された HIV ワクチン設計戦略。 科学。 (ニューヨーク州ニューヨーク州) 366、eaax4380 (2019)。

記事 CAS Google Scholar

トレント デ ラ ペーニャ、A. 他過剰安定化による天然様 HIV-1 エンベロープ三量体の免疫原性の改善。 Cell Rep. 20、1805 ～ 1817 年 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Moyo, T.、Kitchin, D. & Moore, PL ワクチン設計のための HIV-1 エンベロープの N332 スーパーサイトの標的化。 専門家の意見。 Therapeutic Targets 24、499–509 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

ヘインズ、BFら。 広範な中和抗体を誘導する HIV-1 ワクチンの戦略。 ナット。 イミュノール牧師。 23、142–158 (2022)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Griffith, SA & McCoy, LE bnAb にするか bnAb にしない: HIV-1 に対する広範な中和抗体の定義。 フロント。 イムノール。 12、708227 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アンソニー、C.ら。 株特異的応答と広範な中和反応との連携により、ウイルスの逃走が制限され、広範な中和エピトープの曝露が延長されました。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 91、e00243–18 (2017)。

記事 Google Scholar

スワンソン、Ｏ．ら。 機能的にありそうもない変異を持つ中和抗体 B 細胞系統メンバーに結合する HIV エンベロープの迅速な選択。 Cell Rep. 36、109561 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

フェラ、D. et al. HIV エンベロープ V3 領域模倣物は、広範な中和抗体系統エピトープの重要な特徴を具体化しています。 ナット。 共通。 9、1111 (2018)。

論文 ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

ノガル、B.ら。 HIV エンベロープ三量体誘発自己中和抗体は、N332 グリカン スーパーサイトと重複する領域に結合します。 科学。 上級 6、eaba0512 (2020)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wiehe、K.ら。 変異誘導ワクチン設計: HIV 広範な中和抗体誘導のための増強免疫原の開発戦略。 bioRxiv、2022.2011.2011.516143。 10.1101/2022.11.11.516143 (2022)。

Kepler、TB B 細胞クローン系統の再構築。 I. 観察されていない祖先の統計的推論。 F1000解像度 2、103 (2013)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

サンダース、KO et al. 安定化された HIV-1 エンベロープ免疫化は、CD4b に対する中和抗体を誘導し、粘膜感染からマカクを保護します。 科学。 翻訳。 医学。 14、eabo5598 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Escolano、A. et al. 免疫化により、マウスおよびマカクザルの HIV-1 V3 グリカンに特異的な B 細胞が増殖します。 ネイチャー 570、468–473 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Punjani, A.、Rubinstein, JL、Fleet, DJ & Brubaker, MA crioSPARC: 教師なしの迅速なクライオ EM 構造決定のためのアルゴリズム。 ナットメソッド。 14、290 (2017)。

Grant, T. & Grigorieff, N. ロタウイルス VP6 の 2.6 Å 再構成を使用した単一粒子クライオ EM の最適露光量の測定。 Elife 4、e06980 (2015)。

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: 電子顕微鏡写真からの高速かつ正確な焦点ぼけ推定。 Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． 192、216–221 (2015)。

Grant, T.、Rohou, A. & Grigorieff, N. cisTEM、単一粒子画像処理用の使いやすいソフトウェア。 eLife 7、e35383 (2018)。

タン、G.ら。 EMAN2: 電子顕微鏡用の拡張可能な画像処理スイート。 Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． 157、38–46 (2007)。

Bartesaghi、A. et al. 原子分解能のクライオ EM による β-ガラクトシダーゼの構造。 構造 26、​​848–856.e843 (2018)。

ジバノフ、J.ら。 RELION-3 での自動高解像度クライオ EM 構造決定のための新しいツール。 eLife 7、e42166 (2018)。

Eswar、N.ら。 Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc) で博士号を取得。 （2001年）。

Zhou, T. et al. 抗体 VRC01 による HIV-1 の広範囲かつ強力な中和の構造的基礎。 サイエンス 329、811 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ペッターセン、EF 他。 UCSF ChimeraX: 研究者、教育者、開発者向けの構造視覚化。 タンパク質科学。 : 出版物。 タンパク質学会 30、70–82 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Croll, T. ISOLDE: 低解像度の電子密度マップにモデルを構築するための物理的に現実的な環境。 アクタクリスタログル。 宗派。 D. 74、519–530 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、VBら。 MolProbity: 高分子結晶学の全原子構造検証。 Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66、12–21 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Barad, BA et al. EMRinger: 3D クライオ電子顕微鏡用の側鎖指向モデルおよびマップ検証。 ナット。 方法 12、943 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schrodinger, L. PyMOL 分子グラフィックス システム。 （2015年）。

Humphrey, W.、Dalke, A. & Schulten, K. VMD: 視覚的分子動力学。 Ｊ．Ｍｏｌ． グラフ。 14、33–38 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

クライオ EM データは、米国科学財団の支援を受けるノースカロライナ リサーチ トライアングル ナノテクノロジー ネットワーク (RTNN) のメンバーであるデューク大学共有材料計測施設 (SMIF) のデューク クリオスで収集されました (賞番号 ECCS-2025064)。 ) 国立ナノテクノロジー調整インフラストラクチャー (NNCI) の一部として、国立クライオ EM アクセスおよびトレーニングセンター (NCCAT) およびニューヨーク構造生物学センターにあるサイモンズ電子顕微鏡センターで、NIH 変革共通基金の支援を受けています。高解像度低温電子顕微鏡プログラム (U24 GM129539) およびサイモンズ財団 (SF349247) およびニューヨーク州からの助成金による。 この研究では、デューク大学の Duke Research Computing (http://rc.duke.edu; NIH 1S10OD018164-01) が提供する計算リソースを使用しました。 三量体の抗原性分析については、Advaiti Kane と Parth Patel に感謝します。 資金提供: このプロジェクトは、NIH、NIAID、HIV/AIDS ワクチン開発のためのエイズコンソーシアム部門 (CHAVD) 助成金 UM1AI144371 (BFH)、R01AI145687 (PA)、NIAID 構造生物学センター U54AI170752 (PA)、NIGMS 助成金 R01GM141223 (AB) によって支援されました。 ）、およびデューク・ヘルス・イニシアチブの翻訳（PAおよびRCH）。

これらの著者は同様に貢献しました: Rory Henderson、Ye Zhou。

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学医学部医学・免疫学部

ロリー・ヘンダーソン、ケビン・ウィーエ、S. ムニール・アラム、バートン・F・ヘインズ

デュークヒトワクチン研究所、デューク大学医学部、米国ノースカロライナ州ダーラム

ロリー・ヘンダーソン、ヴィクトリア・ストールズ、ケビン・ウィーエ、ケビン・O・サンダース、カラ・アナスティ、マギー・バー、ロバート・パークス、S・ムニル・アラム、バートン・F・ヘインズ、プリヤンヴァダ・アチャリヤ

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学コンピューターサイエンス学部

周葉 & アルベルト・バルテサーギ

デューク大学医学部外科、米国ノースカロライナ州ダーラム

ケビン・O・サンダース & プリヤンヴァダ・アチャリヤ

理論生物学および生物物理学、ロスアラモス国立研究所、ロスアラモス、ニューメキシコ州、米国

クシティジ・ワグ & ベット・コーバー

ニューメキシココンソーシアム、ロスアラモス、ニューメキシコ州、米国

クシティジ・ワグ & ベット・コーバー

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学医学部病理学教室

S・ムニル・アラム

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学医学部生化学教室

アルベルト・バルテサーギ & プリヤンヴァダ・アチャリヤ

米国ノースカロライナ州ダーラムのデューク大学電気およびコンピュータ工学科

アルベルト・バルテサーギ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

RH、AB、PA が研究を主導しました。 RH、YZ、VS、PA はクライオ EM 構造を決定および分析しました。 VS で発現および精製されたタンパク質。 KOS はタンパク質の発現と精製を監督しました。 K.W. そしてBKは中和シグネチャを実行および分析しました。 KA は SPR アッセイを実施しました。 SMA 監督による SPR アッセイ。 MB および RP は ELISA アッセイを実行しました。 RH はすべての著者の協力を得て原稿を執筆および編集しました。 BFH と PA はこの研究を企画、編集し、資金を獲得しました。 PA は研究を監督し、すべてのデータをレビューしました。

ロリー・ヘンダーソン、バートン・F・ヘインズ、アルバート・バルテサギ、またはプリヤンヴァダ・アチャリヤとの通信。

著者らは、次の競合する利益を宣言します。 この研究に基づく HIV-1 エンベロープの改変を対象とする特許出願がデューク大学によって提出されました。 この申請に基づく科学的使用の制限はありません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Xueling Wu と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Henderson, R.、Zhou, Y.、Stalls, V. 他 DH270 抗体クローン系統を標的とする HIV-1 V3-グリカンの幅広い開発の構造的基礎。 Nat Commun 14、2782 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 8 月 10 日

受理日: 2023 年 4 月 14 日

公開日: 2023 年 5 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38108-1

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。