候補サブユニットワクチンはマウスにおいてMycobacterium avium亜種パラ結核に対する防御免疫を誘導する

npj ワクチン第 8 巻、記事番号: 72 (2023) この記事を引用

589 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

Mycobacterium avium 亜種パラ結核症 (MAP) は、反芻動物の肉芽腫性腸炎であるパラ結核症 (PTB) を引き起こし、世界中の酪農産業の健全な発展と公衆衛生の安全を脅かしています。 市販の不活化ワクチンは完全に防御的ではなく、ウシ結核の診断を妨げるため、我々は、MAP3527、Ag85B、およびMAPのHsp70を異なるタンデム組み合わせで構築した4つの融合タンパク質、すなわち66NC、66CN、90NC、および90CNをテストした。 注目すべきことに、MAP3527N40-232、Ag85B41-330、およびMAP3527C231-361を線形順序で結合する66 kDa融合タンパク質をコードする66NCは、強力かつ特異的なIFN-γ応答を誘導した。 Montanide ISA 61 VG アジュバントに配合された 66NC 融合タンパク質による C57BL/6 マウスの免疫化により、強力な Th1、Th2、および Th17 型免疫応答と強力な抗体応答が生成されました。 66NC ワクチンは、C57BL/6 マウスを毒性の MAP K-10 感染から保護しました。 これにより、体重減少の減少に加えて、細菌負荷が減少し、肝臓と腸の病理学的損傷が改善されました。 報告されている 74 F ワクチンよりも大幅に優れた防御効果も誘導されました。 さらに、ワクチンの有効性は、IFN-γ、TNF-α、IL-17A を分泌する抗原特異的 CD4+ および CD8+ T リンパ球のレベル、ならびにワクチン接種後の血清 IFN-γ および TNF-α レベルと相関していました。 これらの結果は、組換えタンパク質 66NC が、MAP に対する特異的防御を誘導するという点で、防御ワクチンへのさらなる開発に有効な候補であることを示しています。

Mycobacterium avium 亜種パラ結核症 (MAP) は、一般にヨーネ病と呼ばれるパラ結核症 (PTB) を引き起こします。これは、家畜および野生の反芻動物の腸に長期にわたる肉芽腫性炎症を引き起こします。 この症状が進行するにつれて、体重減少、重度の下痢、乳量や体調の低下などの臨床症状が見られます1。 PTB は世界中に分布し、発生率も高く、乳業の持続可能かつ健全な発展を脅かしています2,3。 米国の乳牛の大多数、約 90% が MAP4 に感染しており、米国では年間約 2 億 5,000 万ドルの経済的損失が発生していると推定されています 3。 さらに、MAP は乳児用粉ミルクや小売用低温殺菌牛乳からも検出されており 5,6、この病原体はクローン病、I 型糖尿病、橋本甲状腺炎など多くのヒトの病気で見つかっており 7,8,9 、世界の公衆衛生と健康を脅かしています。社会経済的安全保障。

反芻動物におけるPTBの重症度にもかかわらず、有効なワクチンは開発されていません。 以前に使用された 3 つのワクチン (Mycopar、Silirum、および Gudair) はすべて、油エマルション中に配合された不活化全細胞 MAP です。 しかし、これらのワクチンは完全に予防できるわけではなく1、注射部位に局所的な肉芽腫や膿瘍の形成を引き起こし、おそらく主な障害はウシ結核やPTBに対して定期的に使用される診断検査への干渉である1,10。 効果的な PTB 制御プログラムにとって最も重要な要素は、MAP の糞便排出を減らすことです。 しかし、不活化ワクチンは糞便の排出を最小限に抑えるだけであることがわかっています 11,12。 したがって、米国の研究者らはヨーネ病統合プログラムを通じて協力し、遺伝子ノックアウトアプローチを使用して、MAP1,10の糞便排出を止めると思われる改変生ワクチンを開発した。 実際、生弱毒化MAPワクチンはより優れた予防効果を提供しますが、結核診断検査における潜在的な干渉は排除されません。 さらに、人間が改変された生の MAP に不注意でさらされる可能性も、公衆衛生上の重大な懸念事項です 13,14。

したがって、ウシ結核の診断を妨げない、PTB に対する革新的で効果的なワクチンが緊急に必要とされています。 これらの問題に対処するために、研究者たちはサブユニットワクチンやDNAベースのワクチンなど、さまざまな解決策を模索しています。 MAP 熱ショックタンパク質 70 (Hsp70) は免疫優性抗原 15 であり、組換え MAP Hsp70 ワクチン接種により子牛の糞便中の細菌の排出が長期間減少します 16。 研究により、Hsp70 ワクチンは結核の認識を妨げず、Hsp70 ワクチンを接種した動物は MAP17 に感染した動物と容易に区別できることが明らかになりました。 MAP に感染したウシおよびマウスは、一般に培養濾液タンパク質、特に Ag85B タンパク質に対する迅速かつ強力な T 細胞応答を誘導します 18。 Ribi アジュバントで乳化された組換え MAP Ag85B は、Th1 型と Th2 型の両方の免疫応答を誘導しました 19。 MAP の Ag85B 抗原はトランスジェニックアルファルファで発現され、マウスで長期持続する免疫を誘発しました 20。 MPL アジュバントと混合した MAP3527 および MAP1519 からなる融合タンパク質 74 F、および MAP 抗原 Ag85A-SOD-Ag85B-74F を含む別の融合タンパク質粒子ワクチンは、マウスを MAP 感染から効果的に保護しました 21,22。 さらに、SopE104-Ag85A-SOD-Ag85B および SopE104-74F 遺伝子を保有するサルモネラ菌の弱毒株は、IFN-γ の産生を特徴とする強力かつ持続的な Th1 免疫応答を誘発し、MAP 攻撃に対するマウスの保護を提供しました 23。 PTB に対するサブユニット ワクチンを開発するには、CD4+ および CD8+ T 細胞を優先的に活性化して増殖し、IFN-γ1、21、24 を分泌するマイコバクテリア抗原を同定することが重要です。 以前の研究では、T 細胞および抗体応答を誘導する能力を特徴とするヒツジ、ウシ、およびマウスの制御された感染条件において 3 つの MAP 抗原 (MAP3527、Ag85B、および Hsp70) が同定されています 16、18、21。 本研究では、MAP3527、Ag85B、Hsp70を異なる組み合わせでタンデムに組み合わせた4つの融合タンパク質を構築し、分子量に応じて66NC、66CN、90NC、90CNと名付けました。 我々は、マウスモデルにおけるこれらの融合タンパク質の免疫保護特性をさらに調査しました。

特に、反芻動物感染モデルは PTB ワクチン接種研究に広く使用されています 24,25。 しかし、反芻動物におけるこの病気の潜伏期間が長く、実験実施に費用がかかるため、反芻動物の代わりに非反芻動物実験動物が開発されてきました。 C57BL/6 マウスは、MAP 感染およびワクチン開発を調査するためのモデルとして頻繁に利用されます 21、26、27。 この研究は、モンタニド ISA 61 VG アジュバントと配合された融合タンパク質 66NC の免疫原性と防御効果に焦点を当てており、マウスモデルでポリプロテイン 74 F と比較研究されました。

融合タンパク質の構築に使用される構成と制限酵素部位 (EcoR I および Hind III) を示す 66NC、66CN、90NC、および 90CN の図表示と、N 末端 6 ヒスチジンタグを使用したタンパク質精製に関するデータが示されています。図1aの。 4 つの融合タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は補足配列 1 で入手できます。66NC、66CN、90NC、および 90CN の ORF 長は 1902 bp、1902 bp、2547 bp、および 2547 bp であり、653 aa、653 aa、それぞれ 868 aa、および 838 aa、予測分子量はそれぞれ約 66 kDa、約 66 kDa、約 90 kDa、および約 90 kDa です。 大腸菌内で発現された組換えタンパク質は、Niカラムアフィニティークロマトグラフィーによって精製されました（図1b〜d）。 ポリプロテイン 74 F の精製は以前の報告に従って達成され 21、SDS-PAGE によって分析されました (図 1e)。

a 66NC、66CN、90NC、および 90CN コンストラクトの概略図。 b 組換え90CN融合タンパク質の精製。 ライン M、タンパク質分子量マーカー。 ライン 1、再生後の 90CN タンパク質。 ライン 2、樹脂からのフロースルー。 行 3、洗浄前のタンパク質結合樹脂。 行 4、洗浄後のタンパク質結合樹脂。 ライン 5、500 mM イミダゾールによって溶出された精製 90CN タンパク質。 c 組換え90NC融合タンパク質の精製。 ライン M、タンパク質分子量マーカー。 ライン 1、再生後の 90NC タンパク質。 ライン 2、樹脂からのフロースルー。 行 3、洗浄前のタンパク質結合樹脂。 行 4、洗浄後のタンパク質結合樹脂。 ライン 5、500 mM イミダゾールによって溶出された精製 90NC タンパク質。 d 組換え66CNおよび66NC融合タンパク質の精製。 ライン M、タンパク質分子量マーカー。 ライン 1、樹脂からのフロースルー。 ライン 2、洗浄前のタンパク質結合樹脂。 行 3、洗浄後のタンパク質結合樹脂。 ライン 4 および 5、それぞれ 500 mM および 1 M イミダゾールによって溶出された精製 66CN タンパク質。 ライン6、溶出後のタンパク質結合樹脂。 ライン 7、樹脂からのフロースルー。 8行目、洗浄前のタンパク質結合樹脂。 行9、洗浄後のタンパク質結合樹脂。 ライン 10 および 11、それぞれ 500 mM および 1 M イミダゾールによって溶出された精製 66NC タンパク質。 e 組換え 74 F 融合タンパク質の精製。 ライン M、タンパク質分子量マーカー。 ライン 1、樹脂からのフロースルー。 ライン 2、洗浄前のタンパク質結合樹脂。 行 3、洗浄後のタンパク質結合樹脂。 ライン 4 および 5、それぞれ 200 mM および 500 mM イミダゾールによって溶出された精製 74 F タンパク質。 すべてのゲルは同じ実験から得られ、並行して処理されました。

IFN-γ は、マイコバクテリアなどの細胞内病原体と戦うのに重要です 28,29。 最適なアジュバントと免疫経路をスクリーニングするために、Montanide ISA 61 VG、Montanide GEL 02 PR、または Montanide ISA 206 VG で乳化した 66NC 融合タンパク質をマウスの皮下または筋肉内に免疫しました。 2回目の免疫化から3週間後、IFN-γ ELISpotアッセイのために免疫化マウスから脾細胞を収集しました(図2a)。 Montanide ISA 61 VG アジュバントに配合した 66NC でマウスを皮下免疫すると、66NC 融合タンパク質と共培養した脾臓リンパ球を in vitro で刺激した後、他の 11 グループと比較して最も強い IFN-γ 応答が生成されました（図 2b）。 、c）。 最適な免疫原をスクリーニングするために、66NC、66CN、90NC、または 90CN 融合タンパク質と混合した Montanide ISA 61 VG アジュバントをマウスの皮下に免疫しました。 66NCによるマウスの免疫化は、66CN、90NC、および90CN免疫化マウスと比較して、66NC融合タンパク質に対するIFN-γ反応の最も強力な産生を刺激した(図2d、e)。 上記の結果は、免疫化、アジュバント、および免疫原の最良の経路は、それぞれ皮下注射、モンタニド ISA 61 VG アジュバント、および 66NC 融合タンパク質であり、C57BL/6 マウスにおいて強力な抗原特異的 IFN-γ 応答を誘導したことを示しています。

ワクチン接種スケジュールの概略図。 b、c IFN-γ ELISpot アッセイを使用して、さまざまなアジュバント Montanide ISA 206 VG (206 VG) で製剤化された 66NC 融合タンパク質を筋肉内 (IM) および皮下 (SC) で免疫したマウスの脾臓リンパ球における抗原特異的 IFN-γ 発現を測定しました。 ）、モンタニド ISA 61 VG (61 VG)、およびモンタニド GEL 02 PR (GEL) を使用し、陰性対照としてアジュバントのみを使用して、指定の抗原で刺激しました。 b IFN-γ ELISpot アッセイの代表的な写真 (少なくとも 3 つの独立した反復による代表的な実験)。 c IFN-γ ELISpot アッセイの定量。 d、e IFN-γ ELISpot アッセイを使用して、Montanide ISA 61 VG アジュバントに配合された融合タンパク質 (66NC、66NC、90NC、および 90CN) で皮下 (SC) 免疫したマウスの脾臓リンパ球における抗原特異的 IFN-γ 発現を測定しました。陰性対照としてアジュバントのみを使用して、示された抗原で刺激しました。 d IFN-γ ELISpot アッセイの写真 (少なくとも 3 つの独立した反復を含む 1 つの実験の代表)。 e IFN-γ ELISpot アッセイの定量。 c、e エラーバーは平均の標準誤差 (SEM) を示します。 一元配置分散分析を使用して統計的有意性を分析し、続いて Tukey の多重比較検定を使用しました。 ***P < 0.001。

マウスを２週間間隔で２回、６１ＶＧアジュバントに混合した５０μｇの６６ＮＣを用いて皮下経路で免疫化し、 ７４ Ｆポリタンパク質をサブユニットワクチン対照として使用した。 2回目の免疫の3週間後、各グループから6匹のマウスを屠殺し、抗66NC抗体、サイトカイン分泌、およびT細胞応答を評価しました（図3a）。 抗体応答に関しては、66NCで免疫したマウスは66NC融合タンパク質に対して強いIgG1およびIgG2a応答を示し、66NCで免疫したマウスの抗体レベルは 74 Fで免疫したマウスの抗体レベルよりも有意に高かった（図3b）。 アジュバントのみの対照群は、66NC に対していかなる特異的な反応も示さなかった。

ワクチン接種スケジュールの概略図。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ６１ ＶＧアジュバント中に配合した５０μｇの６６ＮＣ融合タンパク質を２回（３週間間隔で）皮下注射した。 対照群には、陰性対照としてモンタニド ISA 61 VG アジュバント単独、またはサブユニットワクチン対照として 74 F 混合 MPL アジュバントで免疫したマウスが含まれます。 追加免疫の３週間後、マウスを採血し、屠殺した。 b 抗原特異的な IgG1 および IgG2a アイソタイプを ELISA によって測定しました。 c IFN-γ および IL-4 ELISpot アッセイの写真 (少なくとも 5 つの独立した反復を含む 1 つの実験の代表)。 d、e IFN-γおよびIL-4 ELISpotアッセイの定量。 f サイトカイン陽性 (%Cyt+) 抗原特異的 T リンパ球の割合は、指定の抗原による脾臓 T リンパ球の刺激後の CD4+ および CD8+ における細胞内サイトカイン染色 (ICS) によって定量されました。 g IFN-γ、TNF-α、およびIL-17Aの血清サイトカインレベルをELISAによって測定した。 d–g エラーバーは平均の標準誤差 (SEM) を示します。 一元配置分散分析を使用して統計的有意性を分析し、続いて Tukey の多重比較検定を使用しました。 **P < 0.01、***P < 0.001。

Th1 細胞は、IFN-γ、TNF-α、IL-2 などのサイトカインを産生します。IFN-γ はこの系統を特徴付けるサイトカインです 30。 Th1 細胞と比較して、Th2 細胞は IL-4、IL-5、および IL-13 を生成します。IL-4 は、ナイーブ T 細胞の Th2 細胞への形質転換に寄与する主要なサイトカインです 30。 Th1 および Th2 免疫応答は、IFN-γ および IL-4 ELISpot アッセイによって評価されました。 66NCワクチン接種は、74Fワクチン接種またはアジュバントワクチンのみよりも高い相対数のIFN-γおよびIL-4発現脾臓リンパ球を誘導しました（図3c〜e）。

続いて、ICS 分析を通じて脾臓における抗原特異的 T リンパ球反応を評価しました。 74Fワクチン接種マウスと比較して、66NCワクチン接種マウスの脾臓では、より高いIFN-γ、TNF-α、およびIL-17A分泌CD4+ TおよびCD8+ T細胞応答が観察されました（図3f）。 さらに、血清中の IFN-γ、TNF-α、および IL-17A のレベルを ELISA によって測定しました。 これら 3 つのサイトカインのレベルは、 74 F で免疫したマウスまたはアジュバントのみを与えたマウスと比較して、66NC で免疫したマウスの方が高かった (図 3g)。 これらのデータは、66NC ワクチン接種マウスが Th1、Th2、および Th17 型の免疫応答と強力な抗体応答を示したことを示唆しています。

6週目に、ワクチン接種マウスを109 CFUのMAP K-10で腹腔内経路で攻撃し、防御効果を評価するために攻撃後2、4、8、および12週目に安楽死させた（図4a）。 PTB の臨床段階では、症状には持続的な下痢、体重減少、進行性の衰弱が含まれます 31。 実験期間中、攻撃後 2、4、8、および 12 週間でワクチン接種マウスの体重をモニタリングしました。 ６６ＮＣワクチン接種マウスの体重増加は、攻撃後２週目のブランクマウスの体重増加に匹敵し、７４Ｆまたはアジュバント単独ワクチン接種マウスよりも有意に高かった。 これらの違いは、4、8、12週目でも持続しました（図4b）。 体液性免疫は MAP32 との戦いに有益である可能性があることが示唆されています。 免疫後 2 週間間隔で測定した 2 ～ 18 週目の血清中の抗体レベルを ELISA で測定しました。 66NCで免疫したマウスのIgGおよびIgMのレベルは、 74 Fまたはアジュバントのみで免疫したマウスのレベルよりも高く、IgM抗体はワクチン接種後12週間まで持続しました（図4c、d）。 注目すべきことに、IgG抗体力価は18週間まで高いレベルを維持した(図4c)。 細菌量（CFU）を、攻撃後のさまざまな時点でマウスの肝臓および腸で測定しました。 肝臓では、チャレンジ後２、４、および８週間で、７４Ｆまたはアジュバント単独ワクチン接種マウスと比較して、６６ＮＣワクチン接種マウスにおいてＭＡＰ負荷が有意に減少した（図４ｅ）。 ツィール・ニールセン染色を使用すると、攻撃後2週間でワクチン接種されたマウスの肝臓で質的に同様の結果が観察されました（図4g）。 66NCでワクチン接種されたマウスは、MAP K-10攻撃の2週間後および4週間後に、74Fまたはアジュバントのみワクチン接種されたマウスと比較して、腸内のMAP負荷の有意な減少を示した（図4f）。 攻撃後 12 週間では肝臓、8 週間と 12 週間では腸からは細菌は培養されませんでした。

ワクチン接種とMAP攻撃のタイムラインの概略図。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ６１ ＶＧ（６１ ＶＧ）アジュバント中に配合された５０μｇの６６ＮＣ融合タンパク質を２回（３週間間隔で）皮下注射した。 対照群には、陰性対照としてモンタニド ISA 61 VG アジュバント単独、またはサブユニットワクチン対照として 74 F 混合 MPL アジュバントで免疫したマウスが含まれます。 追加免疫の３週間後、マウスを腹腔内注射によりＭＡＰ Ｋ－１０で攻撃した。 b 体重は、MAP チャレンジ後 2、4、8、および 12 週間測定されました (各グループ n = 6)。 IgG (c) および IgM (d) 抗体レベルをモニタリングします。 血清を収集し、初回ワクチン接種後 2、4、6、8、10、12、14、16、および 18 週間後に、IgG と IgM の両方の特異的抗 66NC または 74 F 抗体応答を ELISA によって測定しました。 ワクチン接種後 2、4、および 8 週間、MAP K-10 を腹腔内注射してチャレンジしたマウスの肝臓 (e) および腸 (f) における細菌量の定量化を評価しました。 g MAP チャレンジから 2 週間後のワクチン接種マウスの肝臓における Ziehl-Neelsen 抗酸菌染色の代表的な画像を示します (スケールバー、100 μm (上) および 10 μm (下))。 下の画像は、上の画像の輪郭部分を拡大したものです。 b、e、f データは、少なくとも 3 ～ 6 回の独立した反復からの累積結果を示します。 平均値±SEMおよび二元配置分散分析を使用して統計的有意性を分析し、続いてTukeyの多重比較検定を使用しました。 ns、有意ではない。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001。

攻撃から2週間後のマウスの剖検後に得られた肝臓および腸のサンプルに対して、巨視病理学および組織病理学を実施した。 74 Fおよびアジュバントのみで免疫したマウスでは、肝臓表面に多数の肉芽腫が見られた。 対照的に、66NCで免疫したマウスでは肉芽腫が少なく、より小さくなりました(図5a、b、黒い矢印)。 さらに、 74 Fおよびアジュバントのみで免疫したマウスでは腸上の目に見える巨大肉芽腫が観察されたが、66NCワクチン接種マウスには目に見える病理はなかった(図5c、d、黒い矢印)。 組織病理学に関しては、アジュバントのみを投与されたマウスの肝臓サンプルでは、​​複数の微小肉芽腫 (黒の矢印) が示され、局所的な可視の広い領域の壊死により巨肉芽腫 (緑の矢印) が形成されました。

巨視的病理学を評価するために、ワクチン接種後２週間、ＭＡＰ Ｋ－１０の腹腔内注射によってチャレンジされたマウスの肝臓および腸の写真を撮影した。 1 つの画像は、少なくとも 5 つの独立した反復を含む 1 つの実験を表します。 a 肝臓の巨視的病理学的変化。 モンタニド ISA 61 VG (61 VG): 多数の巨肉芽腫 (黒矢印)、66NC: 少数の微小肉芽腫 (黒矢印)、74 F: 多数の巨肉芽腫 (黒矢印)。 b 肝臓の巨視的病理スコア。 c 腸内の巨視的病理学的変化。 モンタニド ISA 61 VG (61 VG): 巨肉芽腫 (黒矢印)、66NC: 目に見える病理なし、74 F: 巨肉芽腫 (黒矢印)。 d 腸の巨視的病理学的スコア。 b、d 平均 ± SEM、および一元配置分散分析を使用して統計的有意性を分析し、続いて Tukey の多重比較検定を使用しました。 ns、有意ではない。 *P < 0.05; ***P < 0.001。

対照的に、66NCワクチン接種マウスの肝臓には、複数の微肉芽腫のみが存在しました（黒い矢印、図6a、b）。 さらに、74 F ワクチン接種マウスでは、漿膜の肉芽腫 (緑色の矢印) および実質内の複数の微小肉芽腫 (黒色の矢印) が観察されました。 同様に、アジュバントのみまたは 74 Fワクチン接種マウスの腸には、漿膜表面に巨大肉芽腫があった(緑色の矢印)。 さらに、多くの炎症細胞が筋層や固有層に浸潤しています（青色の矢印）。 対照的に、66NCワクチン接種マウスの腸には病理はありませんでした（図6c、d）。 上記の結果は、Montanide ISA 61 VG アジュバントに配合された 66NC 融合タンパク質が MAP K-10 に対する C57BL/6 マウスの保護の向上に寄与し、MPL アジュバントに混合された 74 F 融合タンパク質より優れていることを示唆しています。

ワクチン接種後2週間、MAP K-10を腹腔内注射してチャレンジしたマウスのヘマトキシリンおよびエオシンで染色した肝臓および腸切片の組織病理学を評価した。 1 つの画像は、少なくとも 5 つの独立した反復を含む 1 つの実験を表します。 a 肝臓の組織病理学的変化 (スケールバー、200 μm (上) および 50 μm (下))。 モンタニド ISA 61 VG (61 VG): 巨肉芽腫 (緑色の矢印) および多発性微肉芽腫 (黒色の矢印)、66NC: 多発性微肉芽腫 (黒色の矢印)、74 F: 巨大肉芽腫 (緑色の矢印) および多発性微肉芽腫 (黒色の矢印) 。 下の画像は、上の画像の輪郭部分を拡大したものです。 b 肝組織病理学スコア。 c 腸の組織病理学的変化（スケールバー、200μm（上）および50μm（下））。 モンタニド ISA 61 VG (61 VG): 巨肉芽腫 (緑の矢印) および炎症性細胞浸潤 (青の矢印)、66NC: 病変なし、74 F: 巨肉芽腫 (緑の矢印) および炎症性細胞浸潤 (青の矢印)。 下の画像は、上の画像の輪郭部分を拡大したものです。 d 腸の組織病理学スコア。 b、d 平均±SEMおよび一元配置分散分析を使用して統計的有意性を分析し、続いてTukeyの多重比較検定を実行しました。 ns、有意ではない。 *P < 0.05; **P < 0.01。

免疫後のマウスにおけるサイトカインレベルと細菌量（CFU）の間の相関関係を調査するために、脾臓からの抗原特異的サイトカイン分泌（Cyt + ）、CD4+、またはCD8+ Tリンパ球とワクチン接種マウスの血清サイトカインレベルを評価しました。 MAP K-10チャレンジから2週間後。 66NC免疫化により、脾臓におけるIFN-γ、TNF-α、およびIL-17A分泌抗原特異的CD4+またはCD8+T細胞反応が、攻撃後の74Fワクチン接種またはアジュバント単独の場合よりも高くなりました（図7a）。そして、MAP K-10に対して免疫したマウスの血清中のIFN-γおよびTNF-αのレベルについては、一貫した結果が観察された。 しかし、残念ながら、IL-17A は血清中に検出されませんでした (図 7c)。 IFN-γ- (P = 0.00033 または P = 0.029)、TNF-α- (P = 0.0039 または P = 0.005)、IL-17A- (P = 0.02 または P = 0.13)、および IFN-γ + TNF-脾臓におけるα + IL-17A-(P = 0.00042 または P = 0.0075) 分泌抗原特異的 CD4+ または CD8+ T 細胞は、肝臓における細菌負荷の減少 (図 7b)、および IFN-γ レベル (P =血清中のTNF-α（P = 0.00071）、およびIFN-γ + TNF-α（P = 0.0047）も、肝臓における細菌負荷の減少と相関していました（図7d）。 腸でも一貫した結果が見られ（補足図1）、MAPに対する防御にはIFN-γ、TNF-α、IL-17Aが重要であることが示唆されています。

a 示された抗原でワクチン接種したマウスのMAP攻撃から2週間後に細胞内サイトカイン染色によって測定された、サイトカイン陽性(Cyt+)脾臓CD4+およびCD8+T細胞の割合。 b 攻撃後の肝臓におけるCyt+ CD4+およびCD8+ Tリンパ球とCFUのピアソン相関(R)。 c モンタニド ISA 61 VG (61 VG) アジュバントおよびワクチン接種マウス (66NC および 74 F) の血清サイトカイン レベルを、MAP K-10 による攻撃から 2 週間後に評価しました。 d IFN-γおよびTNF-αに対する攻撃後の肝臓におけるサイトカインレベルとCFUとのピアソン相関関係。 少なくとも 5 つの独立した反復実験を行った 1 つの実験を表すデータ、平均値 ± SEM。 一元配置分散分析を使用して統計的有意性を分析し、続いて Tukey の多重比較検定を使用しました。 ns、有意ではない。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001。

不均一な発現系によって生成される、明確に定義された組成物で構成される組換えタンパク質サブユニットワクチンの開発は、近年ますます注目を集めています 33,34。 サブユニットワクチンは体内で複製できないため、より安全であると考えられています35。 適合性の観点から見ると、理想的なサブユニット ワクチンは現在の検査による病気の診断を妨げません。 いくつかの MAP タンパク質が、実験動物において感染に対するさまざまなレベルの防御を誘導することがわかっています 19、36、37。 報告によると、ワクチン開発には組換え抗原の混合物の方が良いことが示唆されています。 しかし、そのようなワクチンを牛や羊に調製して使用するにはコストが高すぎる可能性があります。 この問題に対処するために、融合タンパク質が構築され、マウスモデルを使用して MAP に対する免疫防御を提供する能力がテストされています。 モノホスホリルリピド A (MPL) および臭化ジメチルオクタデシルアンモニウム (DDA) アジュバントとの融合タンパク質である MAP の 74 F が、それぞれマウスとヤギを保護することが判明しました 21,24。 この融合タンパク質の成功に触発されて、我々はMAPの遺伝子map3527、ag85b、およびhsp 70を使用して4つの融合タンパク質を構築しました（図1a）。 動物用ワクチンのコストは重要なテーマであり、動物用ワクチンの大規模生産に DDA や MPL などの高価な免疫賦活剤を使用するのは法外な費用がかかります。 この研究では、鉱物油アジュバント (モンタニド ISA 61VG およびモンタニド ISA 206 VG) と水ベースのアジュバント (モンタニド GEL 02 PR) をサブユニット ワクチンのアジュバントとして使用することを提案しました。ウシ、ヒツジ、マウスのワクチン研究で広く使用されています38、39、40、41。 非吸収性で刺激性が強いという欠点がありますが、油ベースのアジュバントは酵素による急速な分解から抗原を保護することができ、エマルジョンは抗原の持続性を高めて持続的な免疫応答を誘導します38。

IFN-γ は、牛が MAP42 に感染すると誘発される主要なサイトカインであり、DNA ワクチンで免疫化された子羊における IFN-γ の発現増加により、子羊を MAP 感染から保護できることが研究で示されています 37。 本研究では、異なるアジュバントと組み合わせた 4 つの融合タンパク質 (66NC、66CN、90NC、および 90CN) でマウスを免疫しました。 IFN-γ ELISpot スクリーニングの利用を通じて、免疫原 (66NC) と Montanide ISA 61VG アジュバントの最も効果的な組み合わせを特定しました。 我々は、61VGアジュバントと配合した66NC融合タンパク質でワクチン接種したマウスは、アジュバント単独または74F融合タンパク質で免疫したマウスよりも有意に高い抗原特異的IFN-γ応答を有することを観察した。 細胞媒介性免疫応答は、マイコバクテリアを含む細胞内病原体を排除し、保護を提供するのに最も成功していると考えられています43。 しかし、研究では、T 細胞と B 細胞の両方を介した免疫応答を誘導する複数の成分を含むワクチンの方が、T 細胞免疫のみを刺激するサブユニット ワクチンよりも結核菌 (MTB) H37Rv からの防御に効果的であることが示されています 44。 今回の研究では、66NC 融合タンパク質で免疫したマウスは、アジュバント単独または 74 F で免疫したマウスよりも顕著な抗原特異的 IL-4 応答と強力な抗体応答を示したことが明らかになりました。さらに、潜伏性結核感染中の抗体はファゴリソソームの成熟を促進し、インフラマソームの活性化、マクロファージによる細胞内 MTB45 の死滅を促進します。 さらに、ワクチン接種後の羊の強力な初期 IgG1 応答は、MAP 感染を防ぐために重要でした 32。 BCG ワクチン接種後に生成される Th1 応答は必ずしも防御を示すわけではありません 46 が、Th2 サイトカインである IL-4 はマイコバクテリアに対する防御に関連付けられています 47。 全体として、66NC 融合タンパク質は、抗原特異的な細胞媒介性および体液性免疫応答を誘発することが観察されており、これは MAP に対する防御における重要な要素である可能性があります。

MAP 感染の初期段階では、CD4+ リンパ球は IFN-γ を刺激し、古典的な方法 (M1) でマクロファージを活性化し、TNF-α、IL-1β、IL-6 などの炎症誘発性サイトカインを放出し、殺菌活性を高めます 48。 49、50。 MAP 感染中、CD8+ 細胞傷害性 T 細胞は細胞内 MAP1 の除去において重要な役割を果たします。 われわれは、IFN-γおよびTNF-αを分泌する抗原特異的CD4+またはCD8+ T細胞応答が、2週間の免疫および攻撃を受けた後のC57BL/6マウスの防御と関連していることを発見した。 さらに、MAPに対して免疫したマウスの血清中のIFN-γおよびTNF-αのレベルでも同様の結果が見られた。 また、ワクチン接種後のIL-17A分泌抗原特異的CD4+またはCD8+ T細胞反応が、攻撃2週間後のC57BL/6マウスにおける免疫防御と相関していることも観察した。 ガンマデルタ T (γδT) 細胞およびグループ 3 自然リンパ球 (ILC3) 細胞に部分的に起因すると考えられる IL-17 分泌が、貪食能力と抗原提示を増強する可能性があることを証拠が示唆しています 51,52。 弱毒化MTB ΔLprGワクチンによるワクチン接種後、血清中のIL-17Aレベルの増加は、MTB攻撃後の肺における細菌負荷の減少と関連していた53。 不活化ワクチン Silirum の分析により、ワクチン接種したヤギとワクチン接種していないヤギの間で、単球由来マクロファージによる IL-17A の転写レベルに統計的に有意な差がないことが明らかになりました 54。 我々の研究により、66NCで免疫したマウスの血清には、非免疫群および 74 F免疫群と比較して、有意に高いレベルのIL-17Aが含まれていることが明らかになった。 チャレンジ後 2 週間では血清中の IL-17A を検出できないにもかかわらず、IL-17A を分泌する抗原特異的な CD4+ または CD8 + T 細胞応答が依然として観察できました。 これの主な説明は、MAP28に感染したヤギとMAP55の不顕性感染したウシの両方のPBMCでIL-17の減少が観察されたということである。 さらに、MAP 感染に対して免疫したマウスでは IL-17A サイトカインの分泌が減少する可能性がありますが、ELISA アッセイの濃度感度は制限されています。

臨床症状がない場合、MAP ワクチン接種の予防効果を評価するためのゴールドスタンダードは、組織の病理と細菌量です 56,57。 したがって、66NC の防御効果を評価するために、肝臓と腸が評価の臓器として選択されました。これは、これらが以前の研究で MAP 攻撃後のマウスの感染状態の信頼できる指標であることが判明したためです 26,58。 攻撃から 2 週間後、肝臓と腸の両方で CFU 数の減少が観察され、MAP の除去が示唆されました。 さらに、66NC 融合タンパク質は、ワクチン接種された動物の肝臓における病理学的損傷と抗酸菌の量を減少させることに成功しました。 PTB に罹患している反芻動物は下痢と体重の大幅な減少を経験します59,60。 チャレンジ後の 66NC ワクチン接種マウスの体重を測定しました。 66NCで免疫したマウスの体重は、ブランクマウスの体重と同程度のままであったが、 74 Fおよびアジュバント群で免疫したマウスの体重は異なる程度に減少したのとは対照的である。 結論として、66NC による免疫化は、臓器内の MAP 負荷の大幅な減少、肝臓および腸の病状の改善、および体重の維持によって証明されるように、MAP 感染からマウスを保護する点で 74 F ワクチンよりも有意に効果的であることが実証されました。

要約すると、66NC 融合タンパク質によるワクチン接種により、細菌が制御され、肝臓および腸の病理学的損傷が軽減され、C57BL/6 における MAP K-10 攻撃後の体重減少が減少しました。 攻撃後のマウスの脾臓において、抗原特異的 CD4+ および CD8 + T リンパ球による IFN-γ、TNF-α、および IL-17A の分泌と防御との間に相関関係が観察されました。 さらに、免疫後の血清 IFN-γ および TNF-α レベルは、防御効果と関連していました。 さらに、66NC で免疫したマウスは、74 F で免疫したマウスよりも MAP K-10 に対して優れた防御効果を示しました。融合タンパク質ワクチンに含まれる抗原の独特の特徴により、ウシやヒツジのウシ結核皮膚検査に干渉する可能性は低くなります。 融合タンパク質 66NC サブユニット ワクチンがウシ結核皮膚検査への反応を誘発せずに PTB を防御できるかどうかを確認するには、ウシやヒツジなどの種における追加の研究が必要です。

マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核菌 K-10 を、0.05% Tween 80 (Amresco、米国オハイオ州ソロン) を添加したミドルブルック 7H9 培地 (BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンノゼ) またはミドルブルック 7H10 培地 (BD Biosciences) で増殖させました。グリセロール（Sigma-Aldrich、上海、中国）、10% オレイン酸-アルブミン-デキストロース-カタラーゼ（OADC、BD Biosciences）および 2 mg/L マイコバクチン J（Allied Monitor、米国ミズーリ州フェイエット）、37 °C。 生後 6 週間の雌 C57BL/6 マウスを、Liaoning Changsheng Biotechnology Co. Ltd (遼寧省、中国) から購入しました。 すべての動物実験は、使用する動物の数を最小限に抑えるように設計されており、苦痛と苦痛の両方を最小限に抑えるよう努めました。 この研究は、中国ハルビン獣医学研究所の動物倫理委員会によって承認されました（倫理委員会承認番号 HVRI-IACUC-200723-01）。

66NC は、MAP3527 の約 18.9 kDa N 末端部分 (残基 40 ～ 232、193 aa) のオープン リーディング フレーム (ORF) と、シグナル ペプチド (残基) を持たない Ag85B の約 30.8 kDa との連続接続によって生成されました。 41 ～ 330、290 aa、終止コドンは省略）、C 末端には MAP3527 の約 13.0 kDa C 末端フラグメント（残基 231 ～ 361、131 aa、終止コドンは省略）が続きます。 さらに、66NC は、MAP3527N40–232-Ag85B41-330–MAP3527C231–361 の線形順序で編成された単一の ORF で構成されます。 66CN は、MA3527C231-361-Ag85B41-330-MAP3527N40-232 ORF から、MAP3527C231-361 から Ag85B、続いて MAP3527N40-232 へのタンデム ORF によって生成されました。

90NC は、Ag85b の代わりに Hsp70 の全長 ORF (終止コドンなし) を含み、MA3527N40–232-Hsp70-MAP3527C231–361 ORF によってコードされます。 同様に、90CN には Ag85b の代わりに Hsp70 が含まれていますが、これは MA3527C231–361-Hsp70-MAP3527N40–232 ORF によってコード化されています。

map3527N40–232 および map3527C231–361 遺伝子は、PrimeSTAR Max DNA ポリメラーゼ (TaKaRa Bio、北京、中国) および MAP3527N-F/R および MAP3527C-F/R プライマーをそれぞれ使用して、MAP K-10 のゲノムから増幅されました (補足)表1）。 作成するPCR反応手順は以下の通りです。 98 °C で 5 分間の予備変性、98 °C で 10 秒の変性、65 °C で 15 秒のアニーリング、72 °C で 10 秒の伸長を 30 サイクル、その後 72 °C で 1 分間最終伸長1分。 PCR産物はPCR精製キット(TIANGEN、北京、中国)を使用して精製した。 次に、それらを、Trelief SoSoo Cloning Kit (TSINGKE、北京、中国) を使用して 50 °C で、Nde I と EcoR I で二重消化した pET28a ベクター (Novagen、ダルムシュタット、ヘレナ、ドイツ) に別々にライゲーションしました。 15分。 次いで、連結産物を大腸菌（E.coli）DH5αに形質転換し、pET28a-MAP3527NおよびpET28a-MAP3527Cと名付けた正しいプラスミドを有するコロニーをPCRおよびDNA配列決定によって決定した。 次に、map3527N40-232 および map3527C231-361 遺伝子を、それぞれ MAP3527NN-F/R プライマーおよび MAP3527CC-F/R プライマーを使用して再度増幅し (補足​​表 1)、二重結合した pET28a-MAP3527C および pET28a-MAP3527N にライゲーションしました。 Trelief SoSoo Cloning Kit を使用して、Hind III および Xho I によって消化されます。 最後に、連結産物をPCRによって同定し、DNA配列決定によって検証し、pET28a-MAP3527N-MAP3527CおよびpET28a-MAP3527C-MAP3527Nと命名した。

ag85b (1 ～ 40 aa シグナルペプチド配列なし) および hsp70 遺伝子は、MAP K-10 ゲノムをテンプレートとして使用し、Ag85BNC-F/R、Ag85BCN-F/R、Hsp70NC-F/R、および Hsp70CN-F を使用して増幅されました。 /R プライマーを使用して、Trelief SoSoo Cloning Kit を使用して、EcoR I と Hind III で二重消化された pET28a-MAP3527N-MAP3527C および pET28a-MAP3527C-MAP3527N 構築物にサブクローニングしました。 ライゲーション後、生成物を大腸菌 DH5α に形質転換し、正しいインサートと配向を含む形質転換体を PCR で確認し、DNA 配列決定で確認しました。 66 kDa (66NC および 66CN) および 90 kDa (90NC および 90CN) 融合タンパク質をコードする最終構築物は、次の線形順序で編成された単一の ORF で構成されます: MAP3527N-Ag85B-MAP3527C、MA3527C-Ag85B-MAP3527N、MA3527N-Hsp70- MAP3527C、および MA3527C-Hsp70-MAP3527N。

組換えプラスミドを、50μg/mLカナマイシンを含むLB培地中で大腸菌BL21株(DE3)中で発現させた。 組換えプラスミドを含むBL21の一晩増殖させた培養物を、50μg/mLカナマイシンを含むLB培地1Lに添加し、振盪しながら37℃で増殖させた。 培養物は、1 mM イソプロピル-β-D-チオガラクトシド (IPTG) を使用して、OD600 nm 0.6 ～ 0.8 で 37 °C、350 × g で 4 時間誘導されました。 誘導された細菌細胞を回収し、緩衝液 A (20 mM Tris-HCl-150 mM NaCl-10% グリセロール-pH 8.0) で超音波処理し、33,264 × g で 10 分間遠心分離しました。 ペレットを０．５％ラウロイルサルコシンナトリウムを含む緩衝液Ａに溶解し、次いで０．１ｍＭの酸化型グルタチオンおよび０．９ｍＭの還元型グルタチオンを含む緩衝液Ａに対して２４時間透析した。 次に、透析を受けたタンパク質を 33,264 × g の速度で 30 分間遠心分離し、上清を Ni-NAT 樹脂 (GE Healthcare Life Sciences、スウェーデン、ウプサラ) にロードしました。 各標的タンパク質を溶出緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ－１５０ｍＭ ＮａＣｌ－５％グリセロール－５００ｍＭイミダゾール－ｐＨ８．０）で溶出した。 各精製タンパク質を、エンドトキシンを除去するためにToxinEraserエンドトキシン除去キット(Genscript、南京、中国)に供し、質量分析分析によって確認した。

74 F の構築手順は以前のレポートで参照されました21。 簡単な説明を以下に示します。 正しい MAP3527C183-361 遺伝子産物を pET17b ベクターにライゲーションし、続いて MAP1519N1-460 産物を pET17b-MAP3527C183-361 にライゲーションしました。 最後に、MAP3527N33-180 産物を pET17b-MAP3527C183-361-MAP1519N1-460 にライゲーションしました。 組換えプラスミド (pET17b-MAP3527C183-361-MAP1519N1-460-MAP3527N33-180) を配列決定によって分析し、100 μg/mL のアンピシリンを含む LB 培地で大腸菌 BL21 に形質転換しました。 ７４ Ｆの発現および精製は、上記の方法に従って実施した。 精製された 74 F タンパク質の確認は、質量分析を使用して行われました。

36 匹のマウスを (3 匹のグループで)、Montanide ISA 61 VG (油中水型、Seppic、パリ、フランス)、Montanide ISA 206 VG (油中水型) と混合した 50 μg の 66NC 融合タンパク質で免疫感作しました。 -水中アジュバント、Seppic）またはMontanide GEL 02 PR（水ベースのアジュバント、Seppic）アジュバントを、それぞれタンパク質またはPBS溶液：アジュバントの体積比1：1.5で使用します。 同量のＰＢＳを、陰性対照として上記の３つのアジュバントと別々に混合した。 上記の 6 つのグループは、2 つの予防接種経路を使用してワクチン接種されました。 各グループに、総量 100 μL を 3 週間隔で 2 回投与しました。 18匹のマウスに大腿部に筋肉内(IM)注射し、別の18匹のマウスに背中に皮下(SC)注射した(補足表2)。 15匹のマウス（3匹のグループ）に、Montanide ISA 61 VGアジュバントと50μgの66NC、66CN、90NC、または90CN融合タンパク質またはPBSを加えた総量100μLを、タンパク質またはPBS溶液：アジュバントでの皮下注射により免疫した。体積比はそれぞれ 1:1.5 です。

各グループのすべての動物は、2 回目の免疫の 3 週間後に CO2 吸入によって安楽死させ、IFN-γ ELISpot の製造元の説明書に従って、マウス脾臓リンパ球分離培地キット (TBD Science、天津、中国) を使用して脾臓からリンパ球を単離しました。アッセイ。 手続きの詳細は以下の通りです。 マウスの脾臓をハサミを使用して無菌的に分離し、小片に切断し、ホモジネート洗浄液(TBD Science)中で粉砕した。 70 メッシュのふるいを通して単一細胞懸濁液を得た後、350 × g で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄しました。 すべての組織細胞を組織サンプル希釈液 (TBD Science) に再懸濁し、次にリンパ球分離培地 (TBD Science) の表面に添加しました。 脾臓リンパ球は、400×gで30分間遠心分離することによって得られ、その後、洗浄溶液(TBD Science)で洗浄し、付着細胞を除去することによって精製した。

96 匹のマウスをランダムに 4 つのグループに分け、3 週間の間隔で 2 回皮下免疫を与えました。 グループ I (6 匹のマウス) にはいかなる処置も受けず、体重モニタリングのためのブランク対照として機能しました。 グループＩＩ（３０匹のマウス）は、モンタニドＩＳＡ ６１ ＶＧアジュバントのみを投与されたワクチン接種を受けていないマウスのグループとして機能した。 グループIII(30匹のマウス)は、Montanide ISA 61 VGアジュバントと混合した50μg/マウスの66NC融合タンパク質で2回免疫化したマウスから構成された。 グループIV（マウス30匹）を50μg/マウスの 74 Fで免疫し、タンパク質：アジュバント体積比1：1でMPLアジュバント（Sigma Adjuvant System、上海、中国）と組み合わせ、サブユニットワクチン対照として使用した21。 グループ II、III、および IV の 6 匹のマウスから脾細胞および血清サンプルを二次免疫の 3 週間後に採取し、ELISpot、ELISA、および細胞内サイトカイン染色による分析を行って、後述する免疫原性を評価しました。

各グループの残りのマウス (n = 24) に、109 コロニー形成単位 (CFU)/マウスの MAP K-10 を腹腔内注射してチャレンジしました。 攻撃後 2、4、8、および 12 週間で、1 グループあたり 6 匹のマウスを CO2 吸入によって安楽死させ、滅菌ハサミを使用して肝臓と腸を収集し、病理検査のために観察および写真撮影し、2 つの部分に分けました。 1 つの部分はコロニーの計数に使用され、もう 1 つの部分は組織病理学分析のために 10% ホルムアルデヒドで灌流されました。 さらに、細胞内サイトカインと分泌サイトカインをそれぞれ分析するために、チャレンジ後 2 週間で 1 グループあたり 6 匹のマウスの脾細胞と血清サンプルを収集しました。

66NC または 74 F に対する抗原特異的免疫応答は、Liu J et al. に従って、IFN-γ および IL-4 ELISpot アッセイによって評価されました。 若干の変更を加えた61。 方法の詳細は以下の通り。 単離した脾臓リンパ球 (ウェルあたり 5 × 105 細胞) を、抗 IFN-γ または IL-4 モノクローナル抗体でプレコートした 96 ウェルプレートに添加し、10 μg/mL 66NC または 74 F 融合体で 37 °C で 48 時間刺激しました。タンパク質。 同量のPBSを陰性対照として添加した。 IFN-γ および IL-4 分泌脾細胞の数は、それぞれマウス IFN-γ または IL-4 ELISpot キット (Dakewe、北京、中国) を製造者の指示に従って使用して測定しました。 プレートを風乾し、iSpot Reader Spectrum (AID、Strassberg、ドイツ) を使用してスポットを数えました。

抗原特異的な IgG、IgM、IgG1、および IgG2a レベルは、従来のサンドイッチ ELISA によって測定されました。 Costar 96 ウェル ELISA プレート (Corning、ニューヨーク州、米国) を、炭酸水素ナトリウム緩衝液 (CBS、pH 8.5) 中の 66NC または 74 F (500 ng/ウェル) で 4 °C で一晩コーティングしました。 次に、非特異的タンパク質結合を防ぐために、5% スキムミルクを PBST (PBS 中の 0.05% Tween-20、pH 7.4) に 37 °C で 2 時間添加しました。 PBSTで3回洗浄した後、血清サンプル（血液はマウスの尾静脈から採取し、1000×gで5分間遠心分離した）の段階希釈物を抗原コートELISAプレートに添加し、37℃で1時間インキュベートした。 h. 洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 結合ウサギまたはヤギ抗マウス IgG (ab6728)/IgM (ab97230)/IgG1 (ab97240)/IgG2a (ab97245) (PBST で 1:10,000 希釈、Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)を二次抗体として使用し、37 °C で 1 時間インキュベートしました。 最後に、プレートを洗浄し、TMB (Sigma-Aldrich、上海、中国) 基質を添加し、発色のために 15 分間インキュベートしました。 停止溶液として 2 M H2SO4 を添加した後、ELx808 マイクロプレートリーダー (BioTek Instruments、Winooski、バーモント州、米国) を使用して、OD450nm で読み出しを実行しました。 血清抗体価は、OD450 陽性/OD450 陰性が 2.1 を超える最大希釈です。

細胞内サイトカイン染色 (ICS) アッセイを使用して、抗原特異的な CD4+ および CD8+ T リンパ球応答を評価し、以前の記載どおりにわずかに変更を加えて実行しました 61。 簡単に説明すると、1.5 × 106 個の脾細胞を 6 ウェル プレートに播種し、最終濃度 10 μg/mL の 66NC または 74 F 融合タンパク質とともに 37 °C で培養しました。 同量のPBSを対照として添加した。 12時間のインキュベーション後、ゴルジプラグおよびゴルジストップ(BD Biosciences)を添加した。 細胞を4時間インキュベートしました。 細胞を、光から保護し、PE 結合抗マウス CD4 (12-0041-82)/CD8α (MCD0804) 抗体 (1:50、ThermoFisher、Waltham、MA、USA) で 4 °C で 30 分間染色しました。 冷FACSバッファーで2回洗浄した後、細胞をCytofix/Cytoperm (BD Biosciences)で固定および透過処理し、その後Perm Washバッファーで2回洗浄した。 細胞は、PE/Cy5 結合抗 IFN-γ (1:50、XMG1.2、ab272255、Abcam)、Alexa Fluor 647 結合ラット抗マウス IL-17A (1:50、TC11-18H10、560184) で染色されました。 、BD Biosciences）、eFluor 450 結合抗マウス TNF-α（1:50、MP6-XT22、48-7321-82、ThermoFisher）を 4 °C で 30 分間、遮光した。 抗体 PE/Cy5 Rat IgG1 (1:50、RG1、NBP1-43076、Novus Biologicals、米国コロラド州リトルトン)、Alexa Fluor 647 Rat IgG1 (1:50、KLH/G1-2-2、0116-31、SouthernBiotech) 、バーミンガム、アラバマ州、米国）およびｅＦｌｕｏｒ ４５０ Ｒａｔ ＩｇＧ１（１：５０、ｅＢＲＧ１、４８－４３０１－８２、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、アイソタイプ制御のための製造業者の指示に従って使用した。 細胞を Perm Wash バッファーで 2 回洗浄し、PBS に再懸濁し、Apogee A50-Micro Nanoscale Flow Cytometry (Apogee Flow Systems、ロンドン、英国) を使用して検出し、Apogee Histogram ソフトウェアで分析しました。

二次免疫後 3 週間および攻撃後 2 週間で血清サンプルを収集し、ワクチン接種していないマウスと比較しました。 製造業者の指示に従って、血清サイトカインをIFN-γ/TNF-α/IL-17AマウスELISAキット(ThermoFisher)によって測定した。 さらに、肝臓および腸における CFU による血清および細胞内サイトカイン レベルの重回帰分析を、R ggplot2 および ggpubr パッケージを使用して実行しました。

MAPチャレンジマウスの肝臓および腸を、MAPチャレンジの2、4、8、および12週間後に無菌条件下で採取し、PBSで洗浄した。 肝臓および腸は、巨視的病理学的分析のためにデジタルカメラ（キヤノン、東京、日本）で撮影された。 肝臓と腸の半分を使用して MAP CFU を数えました。 それらを滅菌 PBST 溶液でホモジナイズし、続いて 2 mg/L マイコバクチン J を含む 7H10 プレート上で段階希釈し、37 °C で 3 ～ 4 週間インキュベートしました。 そして、肝臓と腸の残りの半分を 10% 中性ホルマリンで灌流固定し、脱水し、パラフィン ブロックに包埋し、ヘマトキシリン エオシン (H&E) ジール ニールセン抗酸菌染色のために切片にしました。 画像は、Nikon Eclipse E100 顕微鏡 (Nikon、東京、日本) によって撮影されました。 2 人の独立した病理学者が、二重盲検法で肺と腸の損傷スコアを定量化しました。 巨視的病理スコアリングでは、肝臓表面の肉芽腫領域のパーセンテージを次のスケールを使用して 0 ～ 4 でスコアリングしました: 0 = 正常 (肉芽腫なし)、1 = わずかに増加 (<1%)、2 = 中等度増加 (≧1%) <3%）、3 = 大幅に増加（≧3%）、4 = 顕著な肉芽腫を伴い大幅に増加（>3%）。 腸表面の肉芽腫の数は、次のスケールを使用して 0 から 3 でスコア付けされました: 0 = 肉芽腫なし、1 = 1 つの肉芽腫、2 = 2 つの肉芽腫、および 3 = 3 つの肉芽腫。 組織病理学のスコアリングでは、肝病変の重症度を次のスケールを使用して 0 から 4 でスコアリングしました: 0 = 正常、1 = 多発性微小肉芽腫、2 = 局所壊死を伴う複数の微小肉芽腫、3 = 巨大肉芽腫、4 = マクロ-大量の壊死を伴う肉芽腫。 腸病変の重症度は、次のスケールを使用して 0 から 3 でスコア付けされました: 0 = 正常、1 = 多発性微肉芽腫、2 = 巨肉芽腫、3 = 巨肉芽腫、および炎症性細胞浸潤。

一元配置および二元配置 ANOVA を使用して統計的有意性を分析し、続いて Tukey の多重比較検定を使用しました。 すべての統計分析は、GraphPad Prism 9.0.0 を使用して実行されました。 AP 値 < 0.05 は統計的に有意でした (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001)。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究に関連するすべてのデータは、論文または補足情報に記載されています。 現在の研究のリソース、データ、および試薬は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

de Silva, K. パラ結核に対するよりスマートなワクチンの開発: 初期のバイオマーカーからワクチン設計まで。 イムノール。 改訂 301、145–156 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

Verteramo Chiu、LJ 他乳牛群におけるパラ結核の経済的制御戦略のエージェントベースのモデル評価。 J. デイリー サイエンス 101、6443–6454 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Losinger、WC ヨーネ病に関連した牛乳生産量の減少が米国の乳業経営に及ぼす経済的影響。 J.乳製品研究所。 72、425–432 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロンバード、JE et al. マイコバクテリウム・アビウム亜種の群れレベルの蔓延率 2007 年に米国の乳牛群におけるパラ結核感染。 獣医。 医学。 108、234–238 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ボツァリス、G. et al. ファージ PCR により乳児用粉ミルク中の生存可能な Mycobacterium avium 亜種パラ結核菌が検出され、培養により確認されました。 Int J. 食品微生物。 216、91–94 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジェラード、ZE 他小売低温殺菌牛乳における Mycobacterium avium 亜種パラ結核菌の生存。 食品微生物。 74、57–63 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Naser, SA、Ghobrial, G.、Romero, C.、Valentine, JF クローン病患者の血液から採取した Mycobacterium avium 亜種パラ結核菌の培養。 ランセット 364、1039–1044 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

ビッティ、ML 他。 マイコバクテリウム・アビウム亜種イタリアの1型糖尿病小児患者コホートにおけるパラ結核。 クリン。 開発者イムノール。 2012、785262 (2012)。

PubMed Google Scholar

D'Amore, M.、Lisi, S.、Sisto, M.、Cucci, L. & Dow, CT 橋本甲状腺炎およびメルカーソン・ローゼンタール症候群のイタリア人患者における Mycobacterium avium 亜種パラ結核症の分子同定。 J.Med. 微生物。 59、137–139 (2010)。

論文 PubMed Google Scholar

ファンス、Y.ら。 牛のヨーネ病に対する防御ワクチン。 微生物 8、1427 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knust, B.、Patton, E.、Ribeiro-Lima, J.、Bohn, JJ および Wells, SJ生物。 混雑する。 獣医。 医学。 准教授 242、663–669 (2013)。

論文 PubMed Google Scholar

CHJ 州カリス、JW 州ヘッセリンク、HW バルケマおよびモンタナ州コリンズ 乳牛群における Mycobacterium avium subsp paratuberculosis の糞便排出を防ぐための不活化ワクチンによる長期ワクチン接種の使用。 午前。 J.獣医。 解像度 62、270–274 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

McFadden, J.、Collins, J.、Beaman, B.、Arthur, M. & Gitnick, G. クローン病におけるマイコバクテリア：DNA プローブにより、ヒト組織からの Mycobacterium avium および Mycobacterium paratuberculosis のカラスバト株が同定されます。 Ｊ．クリン． 微生物。 30、3070–3073 (1992)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McFadden, JJ、Butcher, PD、Chiodini, R. & Hermon-Taylor, J. クローン病から分離されたマイコバクテリアは、マイコバクテリウム種を区別する DNA プローブによって決定されたとおり、パラ結核菌と同一であることが判明しました。 Ｊ．クリン． 微生物。 25、796–801 (1987)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Brujeni, GN & Gharibi, D. Mycobacterium avium subsp. 検出用の DNA 設計鳥 IgY 抗体の開発。 正常なウシの血清中のパラ結核熱ショックタンパク質 70 (Hsp70) および抗 Hsp70 抗体。 応用生化学。 バイオテクノロジー。 167、14–23 (2012)。

論文 PubMed Google Scholar

Koets、A.ら。 マイコバクテリアの 70 kD ヒートショックタンパク質は、ウシパラ結核に対する効果的なサブユニット ワクチンです。 ワクチン 24、2550–2559 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Santema, W.、Hensen, S.、Rutten, V. & Koets, A. ウシパラ結核に対するヒートショックタンパク質 70 サブユニットワクチン接種は、ウシ結核の現在の免疫診断アッセイを妨げません。 ワクチン 27、2312–2319 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロシールズ、V. et al. Mycobacterium avium subsp.の培養濾液に由来する 30 ～ 32 キロダルトンのマイコリル トランスフェラーゼ ファミリー (Ag85) のメンバー。 パラ結核は、マウスやウシの感染初期に認識される免疫優勢な Th1 型抗原です。 感染する。 免疫。 74、202–212 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mullerad、J. et al. パラ結核菌 85B 抗原の免疫原性。 医学。 微生物。 イムノール。 190、179–187 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モンレアル-エスカランテ、E. 他 Mycobacterium avium subsp.の 85B (MAP1609c) 抗原を発現するアルファルファ植物 (Medicago sativa L.) パラ結核はマウスに長期持続的な免疫を誘発します。 モル。 バイオテクノロジー。 63、424–436 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン、LHら。 Mycobacterium avium subsp.に対するマウスの免疫応答新規74F組換えポリタンパク質によるワクチン接種後のパラ結核。 ワクチン 26、1253–1262 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

グプタ、SK et al. 自己組織化粒子ワクチンは強力な免疫反応を誘発し、Mycobacterium avium subsp. を減少させます。 マウスにおけるパラ結核感染。 科学。 議員番号 10、22289 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チャンドラ、S.ら。 Mycobacterium avium subsp.の抗原を発現する弱毒生サルモネラワクチンの免疫応答と防御効果マウスのチャレンジに対するパラ結核。 ワクチン 31、242–251 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kathaperumal、K. et al. 組換え抗原とMycobacterium avium subsp.のポリプロテインの混合物による免疫化後のヤギモデルにおける免疫応答と防御効果の評価。 パラ結核。 ワクチン 27、123–135 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Facciuolo、A. et al. 非経口ワクチン誘発粘膜免疫を分析し、ワクチンの発見を加速するためのウシ腸内マイコバクテリウム感染モデル。 フロントイミュノール。 11、586659 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Veazey、RS et al. C57BL/6 マウスと C3H/He マウスのパラ結核菌感染に対する耐性の比較。 獣医。 微生物。 47、79–87 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bannantine, JP et al. マウスにおける毒性の高いMycobacterium avium亜種パラ結核菌による攻撃に対する防御のための8つの弱毒化生ワクチン候補の評価。 フロントセル感染。 微生物。 4、88 (2014)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Berry, A.、Wu, CW、Venturino, AJ & Talaat, AM ヤギのヨーネ病感染と予防接種の初期段階のバイオマーカー。 フロント。 微生物。 9、2284 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

アーセノー、RJ 他マイコバクテリウム・アビウム亜種パラ結核はウシ単球におけるガンマ インターフェロン誘導性シグナル伝達を阻害します: ヨーネ病の細胞機構への洞察。 感染する。 免疫。 80、3039–3048 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yazdi, AS、Rocken, M. & Ghoreschi, K. 皮膚免疫学: 基本と新しい概念。 セミンイムノパトール。 38、3–10 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Basler, T.、Geffers, R.、Weiss, S.、Valentin-Weigand, P. & Goethe, R. Mycobacterium avium 亜種は、マウスマクロファージモデルにおける炎症促進性メディエーターの示差的発現を誘導する: Mycobacterium avium の病原性増強の証拠亜種パラ結核。 免疫生物学 213、879–888 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

HB プーリーら。 体液性免疫応答は、羊のパラ結核に対するワクチン防御を成功させるために不可欠です。 BMC獣医。 解像度 15、223 (2019)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, M.、Jiang, S. & Wang, Y. Pichia pastoris における組換えサブユニット ワクチンの生産における最近の進歩。 Bioengineered 7、155–165 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ugochukwu、AI、Phillips、PWB & Ochieng、BJ ウシ結核およびヨーネ病に対するサブユニットワクチンの採用と商品化の促進: 食料安全保障に対する政策選択とその影響。 ワクチン (バーゼル) 8, 667 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、ニューハンプシャー州ら。 韓国における産業動物のためのワクチン開発と研究のレビュー。 クリン。 経験値ワクチン。 解像度 1、18–34 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ランゲラー、M. et al. パラ結核の制御ツールとしてのパラ結核菌ヒートショックプロテイン 70。 獣医。 イムノール。 イムノパトール。 87、239–244 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

セチ、LA et al. Mycobacterium avium subsp. の組換えヘパリン結合赤血球凝集素 (HBHA) の免疫原性と細胞接着性パラ結核：機能的乱交か、それとも病原性における役割か？ ワクチン 24、236–243 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Langellotti, CA、Pappalardo, JS、Quattrocchi, V.、Mongini, C. & Zamorano, P. さまざまなアジュバントによる DNA 免疫によるウシ ヘルペスウイルス 1 に対する特異的細胞傷害活性の誘導。 アンチビル。 解像度 90、134–142 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リュー、RDら。 旋毛虫のカテプシン L の分子特性と生化学的特性の決定。 獣医。 解像度 53、48 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ザフラ、R.ら。 羊における肝蛭感染症に対する多価ワクチンの有効性。 獣医。 解像度 52、13 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barasuol、BM et al. Haemophilus parasuis の組換え TbpB に対して生成された抗体の機能的および交差反応性に関する新たな洞察。 科学。 議員 7、10377 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Stabel, JR 末梢血単核球によるガンマ インターフェロンの産生: 潜在性パラ結核を検出するための重要な診断ツール。 J.獣医。 診断します。 Invest 8、345–350 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zeng, G.、Zhang, G. & Chen, X. Th1 サイトカイン、結核に対する防御免疫の真の機能的特徴? 細胞モル。 イムノール。 15、206–215 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sable, SB、Verma, I.、Behera, D. & Khuller, GK 結核に対するヒト免疫認識ベースの多成分サブユニット ワクチン。 ユーロ。 呼吸してください。 J. 25, 902–910 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ルー、LLら。 結核における抗体の機能的役割。 セル 167、433–443 e414 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ミトラッカー、HW et al. BCGワクチン接種によって誘発されるT細胞反応と結核に対する防御の間には相関性が低い。 手順国立アカド。 科学。 アメリカ合衆国。 104、12434–12439 (2007)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sugawara, I.、yamada, H.、Mino, S.、Iwaakura, Y. IL-4 はマイコバクテリア感染に対する防御に必要です。 微生物。 イムノール。 44、971–979 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Alzuherri、HM、Woodall、CJ & Clarke、CJ ヒツジパラ結核における腸内 TNF-α、IL-1 β、および IL-6 発現の増加。 獣医。 イムノール。 イムノパトール。 49、331–345 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Smeed, JA、Watkins, CA、Rhind, SM & Hopkins, J. 羊パラ結核の 3 つの病理学的形態における差次的なサイトカイン遺伝子発現プロファイル。 BMC獣医。 解像度 3、18 (2007)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

フェルナンデス、M. 他ウシパラ結核における肉芽腫性腸病変内のマクロファージのサブセット。 獣医。 パソル。 54、82–93 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アーデイン、A.ら。 グループ 3 の自然リンパ球は、結核に対する初期の防御免疫を媒介します。 ネイチャー 570、528–532 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

コールター、F.ら。 結核感染症および結核疾患におけるヘルパー 17、粘膜関連インバリアント T、およびガンマデルタ細胞からの IL-17 産生。 フロントイミュノール。 8、1252 (2017)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

マルティノ、AJ 他マウスにおける弱毒化Mtb DeltaLprGワクチンの保護効果。 PLoS 病巣。 16、e1009096 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arteche-Villasol、N. et al. Mycobacterium avium subsp. による in vitro 感染に対するワクチン接種および非ワクチン接種ヤギの単球由来マクロファージの初期応答パラ結核。 獣医。 解像度 52、69 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, HE、Park, HT、Jung, YH & Yoo, HS マイコバクテリウム・アビウム亜種不顕性感染牛の全血における免疫調節遺伝子の遺伝子発現プロファイル。 パラ結核。 PLoS One 13、e0196502 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central Google Scholar

スウィーニー、RW パラ結核の伝播。 獣医。 クリン。 北午前。 フードアニメーション。 広報 12、305–312 (1996)。

記事 CAS Google Scholar

ウゾナ、JE et al. ウシ実験感染モデルにおける、組換えIL-12を用いた市販および野外株パラ結核菌ワクチン接種の有効性。 ワクチン 21、3101–3109 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Veazey、RS et al. パラ結核菌を経口接種した C57BL/6 マウスの組織病理学。 J.コンプ。 パソル。 113、75–80 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Eamens, GJ、Walker, DM、Porter, NS & Fell, SA ヤギにおける Mycobacterium avium subsp paratuberculosis の検出のためのプールされた糞便培養。 8月。 獣医。 J. 85、243–251 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Whitlock, RH & Buergelt, C. パラ結核の前臨床症状および臨床症状 (病理学を含む)。 獣医。 クリン。 北午前。 フードアニメーション。 広報 12、345–356 (1996)。

記事 CAS Google Scholar

Liu、J.ら。 DNAワクチン誘発性のCD8+ Tリンパ球エピトープ免疫優勢階層の調節。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 80、11991–11997 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

この研究は、中国国家重点研究開発プログラム（2021YFD1800403）および中国国家自然科学財団（32002256、32273005）の支援を受けました。 文献分析は、Stork ソフトウェア (https://www.storkapp.me) を使用して実行されます。 図の黒いマウスは Figdraw によって描かれました (www.figdraw.com)。 この原稿の作成中に言語面での支援をしていただいた LetPub (www.letpub.com) に感謝します。

Guanghui Dang、Siguo Liu の著者も同様に貢献しました。

中国農業科学院ハルビン獣医研究所細菌疾患部門動物疾病管理予防国家重点研究所、678 Haping Street、Harbin、150069、PR China

Mingzhu Shao、Ning Cui、Yangyang Tang、Fanruo Chen、Yingying Cui、Guanghui Dang、Siguo Liu

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

GD と SL は研究を概念化し、設計し、論文を書きました。 MS が実験を実施しました。 NC、YT、FC、および YC は動物の予防接種と感染症に参加しました。 すべての著者は原稿の内容を検査し、検証しました。

Guanghui Dang または Siguo Liu への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Shao、M.、Cui、N.、Tang、Y. 他サブユニットワクチン候補は、マウスにおいてMycobacterium avium亜種パラ結核に対する防御免疫を誘導する。 npj ワクチン 8、72 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

引用をダウンロード

受信日: 2023 年 2 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 10 日

公開日: 2023 年 5 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00675-1

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供